[發明專利]加帽和未加帽抗體半胱氨酸的大規模生產工藝及其在治療性蛋白綴合中的應用

在審

• 申請號: 201880010840.2
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN110267983A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: K·杜塔;J·M·戈梅斯;F·W·科切;V·B·帕特爾;A·S·普拉沙德;R·L·普羅科皮奧-梅利諾;X·鐘
• 申請（專利權）人: 輝瑞公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/30;A61K47/68
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

通過操控細胞生長條件來優化生成選擇性加帽和未加帽的抗體上半胱氨酸，包括通過培養基組分、批次處理時間或細胞密度故意耗盡細胞培養過程中的半胱氨酸和/或胱氨酸，實現有效產生蛋白，包括抗體?藥物綴合物(ADC)；綴合TNB?加帽的含半胱氨酸蛋白，這是通過使其與還原劑反應和經反應性連接部分綴合蛋白上還原二硫鍵與有效載荷，所述還原劑能從蛋白中分離TNB?加帽部分，而不顯著還原抗體鏈間二硫鍵。

技術領域

本發明的領域是，通過操控細胞生長條件，優化抗體上5-硫代-2-硝基苯甲酸鹽(TNB)加帽的半胱氨酸的產生，允許更有效生成抗體藥物綴合物(ADC)。

發明背景

抗體藥物綴合物(ADC)是通常由抗體組成的一類靶向治療，所述抗體裝有強效的細胞毒性藥物(Chudasama等.Nature Chemistry,2016；Junutula和Gerber,ACS medicinalchemistry letters 2016)。因此，ADC提供向腫瘤選擇性遞送毒性有效載荷的可能性，同時避免脫靶毒性，這通常限制或排除延長治療期中使用化療。作為一個有前景的治療平臺，市場上目前有至少2種獲批ADC產品(本妥昔單抗(brentuximab vedotin)和曲妥珠單抗(trastuzumab emtansine))。在其指數增長中，ADC應具有大量處于臨床評估的治療候選物。

為使ADC實現其治療潛能，需要精細的綴合技術以連接細胞毒性藥物與抗體。包括2種市售ADC在內的大部分現有ADC候選物采用常規非特異綴合方法，經隨機表面賴氨酸或還原的四個鏈間二硫化物的游離半胱氨酸。這產生高度異質性ADC混合物，不僅帶來對生產重復性的挑戰，還顯著降低治療指數。

為解決這些問題，ADC領域正移向位點特異性綴合技術，如基于半胱氨酸(Cys)的位點特異性ADC(Junutula等,Nat Biotechnol 2008))。包含工程化的未配對的半胱氨酸殘基的強親核硫醇側鏈允許迅速且簡單的化學綴合反應以附著多種接頭/負荷，從而提供勻質ADC產品。就這些所得ADC分子而言，已報道了更好定義和改善的藥代動力學(PK)譜。位點特異性平臺有其自身的技術挑戰。當在哺乳動物細胞中產生時，所引入半胱氨酸殘基上的巰基與游離半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)形成二硫化物。這些所謂的Cys-加帽修飾需要在藥物綴合前通過部分還原步驟去除。由于這種處理也使抗體鏈間二硫化物還原，那些還原的抗體鏈間二硫化物隨后必須通過再氧化過程重新形成，包括透析出還原劑、半胱氨酸或谷胱甘肽，并用氧化試劑處理((Junutula等,Nat Biotechnol 2008)。此繁瑣的還原和再氧化過程可能在抗體上引入二硫化物改組及扭曲，這可能對蛋白折疊和蛋白品質產生不利影響，還會導致諸如所得ADC的PK較差等問題。

為解決此潛在問題，開發了使用硝基苯甲酸鹽(TNB)的Cys-加帽新型選擇性還原策略(參見PCT/IB2016/054789，通過引用納入本文)，而不影響抗體鏈間二硫化物。由于其弱氧化還原電位，TNB-加帽(埃爾曼試劑(5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，DTNB)與半胱氨酸巰基的反應產物)是不穩定加帽。顯示還原劑三(3-磺苯基)膦(TSPP)可以選擇性去除TNB-加帽，而不還原內源性二硫化物。此TNB/TSPP過程然后進行直接綴合，可消除常規還原-再氧化步驟的嚴苛條件，使原始抗體折疊保持完整。然而，需要更有效的TNB-加帽方法以優化ADC的商業生產。

發明內容

本發明基于以下發現：抗體上半胱氨酸殘基的加帽狀態能通過優化參數如細胞生長、細胞密度和/或細胞培養來修飾。因此，本發明涉及哺乳動物細胞中的抗體生產工藝，其中未配對的工程化的半胱氨酸殘基保持帶有游離巰基的未加帽狀態，這允許有效修飾，當各種濃度的二硫代硝基苯甲酸鹽(DTNB)在不同細胞培養階段或細胞密度加入時，通常以硫代硝基苯甲酸鹽(TNB)加帽。