[發明專利]加帽和未加帽抗體半胱氨酸的大規模生產工藝及其在治療性蛋白綴合中的應用

在審

• 申請號: 201880010840.2
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN110267983A
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: K·杜塔;J·M·戈梅斯;F·W·科切;V·B·帕特爾;A·S·普拉沙德;R·L·普羅科皮奧-梅利諾;X·鐘
• 申請（專利權）人: 輝瑞公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K16/30;A61K47/68
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

1.一種生成能綴合化學有效載荷的含半胱氨酸蛋白的工藝，所述工藝包括以下步驟：

(a)用能表達含半胱氨酸蛋白的細胞接種細胞生長培養基，所述培養基包含選自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一種或多種生長組分；

(b)溫育所述細胞達到足以耗盡所述生長培養基中所存在的大部分生長組分的細胞密度；和

(c)進一步溫育所述細胞以表達具有一個或多個包含游離巰基的未加帽的半胱氨酸殘基的含半胱氨酸蛋白。

2.如權利要求1所述的工藝，還包括步驟：

(d)將預先確定的加帽部分或其前體引入到所述表達的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一個或多個半胱氨酸用所述預先確定的加帽部分加帽。

3.一種生成能綴合化學有效載荷的含半胱氨酸蛋白的工藝，所述工藝包括以下步驟：

(a)用能表達含半胱氨酸蛋白的細胞接種細胞生長培養基，所述培養基包括選自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一種或多種生長組分；

(b)溫育所述細胞以表達具有一個或多個包含游離巰基的未加帽的半胱氨酸殘基的含半胱氨酸蛋白；和

(c)在步驟(a)、步驟(b)或步驟(a)和(b)中，維持所述一種或多種生長組分濃度低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。

4.如權利要求3所述的工藝，還包括步驟：

(d)將預先確定的加帽部分或其前體引入到所述表達的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一個或多個半胱氨酸用所述預先確定的加帽部分加帽。

5.一種生成能綴合化學有效載荷的含半胱氨酸蛋白的工藝，所述工藝包括以下步驟：

(a)用能表達含半胱氨酸蛋白的細胞接種細胞生長培養基，所述培養基包括選自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一種或多種生長組分，和

(b)溫育所述細胞以表達具有一個或多個包含游離巰基的未加帽的半胱氨酸殘基的含半胱氨酸蛋白，其中所述生長組分在所述溫育后的濃度低于2.0mM、低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。

6.如權利要求5所述的工藝，在所述溫育步驟后還包括步驟：

(c)將預先確定的加帽部分或其前體引入到所述表達的含半胱氨酸蛋白；

其中所述蛋白上的一個或多個半胱氨酸用所述預先確定的加帽部分加帽。

7.如權利要求1-2中任一項所述的工藝，其中通過將所述細胞生長培養基的分數半胱氨酸限制比限制到小于1.0x來耗盡所述生長組分。

8.如權利要求7所述的工藝，其中所述比是約：0.95x、0.90x、0.85x、0.80x、0.75x、0.70x、0.65x、0.60x、0.55x、0.50x、0.45x、0.40x、0.35x、0.30x、0.25x、0.20x、0.15x、0.10x或0.05x。

9.如權利要求1-6中任一項所述的工藝，其中所述含半胱氨酸蛋白選自抗體和融合蛋白。

10.如權利要求1-2中任一項所述的工藝，其中所述達到的細胞密度是至少約1E6細胞/mL。

11.如權利要求10所述的工藝，其中所述細胞密度是至少約：5E6細胞/mL、10E6細胞/mL、50E6細胞/mL、100E6細胞/mL或500E6細胞/mL。

12.如權利要求2、4和6中任一項所述的工藝，其中所述預先確定的加帽部分選自5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)、2-巰基吡啶、二硫代聯吡啶(DTDP)、4-硫代苯甲酸、2-硫代苯甲酸、4-硫代苯磺酸、2-硫代苯磺酸、磺酸甲酯(Ms)、對甲苯磺酸鹽(Ts)和三氟甲基磺酸鹽(Tf)。