[發明專利]可溶性PSGL-1蛋白質變體的純化方法

在審

• 申請號: 201880010814.X
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN110536896A
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: F·馬伊薩諾;F·克里韋林
• 申請（專利權）人: 博萊科瑞士股份有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47
• 代理公司: 11038 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 陳曉娜<國際申請>=PCT/EP2018

本發明公開了純化高酸性重組蛋白質的方法。酸性蛋白質優選PSGL?1的胞外區域或者包含該可溶性部分的融合蛋白和/或嵌合蛋白。純化為三步層析，其包括在陰離子交換固相、疏水相互作用和羥基磷灰石上的分離。純度和收率是最佳的，且該方法能夠容易地放大并自動化。

技術領域

本發明涉及重組蛋白質純化領域，特別涉及用于體內應用的陰離子蛋白質純化。

背景技術

從真核表達系統純化重組蛋白質是一個非常具有挑戰性的問題。據估計，下游加工(包括目標蛋白質的提取、純化和表征)可占總生產成本的80％或更多。達到令人滿意的純化收率和純度水平也確實可能大大延遲了為理解任何新設計的、分離的、重組的蛋白質的潛力所需的初步研究。

事實上，盡管重組蛋白質通常以非常高的水平表達并分泌到培養基中，但是高密度的細胞生長是造成條件培養基中除感興趣蛋白質之外的污染蛋白質和大尺寸分子存在的原因，這可能極大影響純化過程和收率。

事實上，源自生長期間發生的細胞裂解的細胞碎片、蛋白質及其降解產物和核酸是純化方法必須要處理的常見污染物。

在重組蛋白質純化方法中，用抗體或特異性識別復雜混合物中的感興趣蛋白質的其他蛋白質(即蛋白質-A)進行的親和純化方法是最具選擇性的，至少在理論上提供了更高純度的那些方法。盡管重組蛋白質的純化相當普及了，但這些方法無論如何都隱藏了親和配體從純化柱本身泄漏出去的風險，以及這些蛋白質污染物的免疫原性風險。

P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)的復雜翻譯后修飾模式需要真核表達系統來進行其功能性生產，其中對于通過P-選擇素的凝集素結構域的Ca²⁺依賴性識別需要兩種不同的翻譯后修飾(酪氨酸硫酸化以及通過巖藻糖和唾液酸的特定核心2O-連接糖基化)。

PSGL-1是帶負電荷的蛋白質，這是由于胞外區域存在至少3個酪氨酸，在功能性蛋白質中被硫酸化。功能性蛋白質的胞外區域中的高糖基化模式和唾液酸的存在進一步造成其帶負電荷。

PSGL-1是白細胞粘附分子，在生理血流下介導細胞在活化內皮細胞上的栓縛(tethering)和滾動(rolling)。這種活性是白細胞外滲的重要初始步驟。PSGL-1最初被識別為P-選擇素的配體，隨后的工作已表明PSGL-1也是E-選擇素和L-選擇素的配體(參見例如美國專利第6,277,975號)。

因此，在體內診斷系統中的可能用途以及其功能表達所必需的復雜翻譯后需求就代表了具有相當挑戰性的問題。

已經在幾種重組系統中公開了PSGL-1胞外結構域的表達，主要是作為與能夠誘導二聚體形成的伴侶的嵌合蛋白，這代表了功能形式。

US 5,827,817描述了重組蛋白質的制備，其中將對應于成熟蛋白的胞外結構域(氨基酸42-320)的可溶形式PSGL-1(sPSGL-1)與IgG的Fc部分框內融合，產生結合P-選擇素和E-選擇素的二聚體蛋白質，并進行翻譯后修飾。在同一專利實施例14中，還公開了通過強陰離子交換層析、接著低鹽洗脫和凝集素親和層析(由于它們對聚糖的親和力)來純化該重組產物。備選地，在US 6,933,370中描述了與嵌合蛋白的Fc部分結合的蛋白質A基質上的純化。據說這種層析法表現出(預期的)缺點，主要是由于蛋白質A從柱中泄漏導致。

EP 1681298和EP 1681299處理了PSGL-1的重組可溶形式的純化以及從感興趣蛋白質中除去污染DNA的技術問題。據說通過陰離子交換層析、接著通過疏水相互作用固相層析以及通過用高鹽、水醇溶液洗滌或者備選通過金屬螯合層析而實現了目標。

WO01/72769 A2公開了純化PSGL-1或PSGL-1融合蛋白的方法，其通過將這些蛋白質進行陰離子交換層析接著進行疏水相互作用層析來進行。

文獻WO2014/159441 A1和WO2010/051360 A1公開了使用各種層析方法的步驟來純化蛋白質的方法。