[發明專利]可溶性PSGL-1蛋白質變體的純化方法

在審

• 申請號: 201880010814.X
• 申請日: 2018-02-06
• 公開（公告）號: CN110536896A
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: F·馬伊薩諾;F·克里韋林
• 申請（專利權）人: 博萊科瑞士股份有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47
• 代理公司: 11038 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 陳曉娜<國際申請>=PCT/EP2018

1.純化目標可溶性蛋白質的方法，所述蛋白質在N-末端包含P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1 GenBank登錄號Q14242.1)的成熟胞外結構域，所述方法包括將包含所述目標可溶性蛋白質的混合物按以下所示順序進行：

a)強陰離子交換(AE)固相層析，

b)疏水相互作用(HI)固相層析，和

c)羥基磷灰石(HA)固相層析。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述強陰離子交換層析包括將包含目標可溶性蛋白質的混合物與選自Tris、Tricine、三乙醇胺、HEPES、TES、MOPS和磷酸鹽的緩沖液組合上樣到強陰離子交換固相上。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述緩沖液是濃度低于30mM且pH為6.5至8的Tris或磷酸鹽。

4.根據權利要求2-3中任一項所述的方法，還包括用NaCl或KCl鹽水溶液在等度洗脫或通過將鹽水溶液的濃度增加至1M的正梯度洗脫下而將目標蛋白質從所述強陰離子交換固相上洗脫下來。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述疏水相互作用固相是苯基疏水固相。

6.根據權利要求4-5中任一項所述的方法，其中將包含從AE洗脫的目標可溶性蛋白質的混合物上樣到在包含高鹽濃度的上樣緩沖液中的疏水相互作用固相層析上，其中鹽選自：NaCl、硫酸銨和硫酸鉀。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述緩沖液是濃度低于100mM的Tris，鹽是NaCl。

8.根據權利要求7所述的方法，其中在所述Tris緩沖液中，NaCl濃度高于3.5M。

9.根據權利要求5-8中任一項所述的方法，還包括通過應用緩沖溶液將目標蛋白質從疏水相互作用(HI)固相層析中洗脫下來，其中所述NaCl鹽濃度低于2.5M。

10.根據權利要求9所述的方法，其中將包含從HI洗脫的可溶性目標蛋白質的混合物引入到濃度低于15mM且pH為6.5至8的緩沖液中，并上樣到HA柱上。

11.根據權利要求10所述的方法，其中所述緩沖液選自pH為6.6至7.4的Tris和磷酸鹽。

12.根據權利要求10-11中任一項所述的方法，其中所述緩沖液是磷酸鹽且其包含濃度低于0.5mM、優選約0.3mM的CaCl₂。

13.根據權利要求10-11中任一項所述的方法，其中所述緩沖液是Tris且其包含MgCl₂。

14.根據權利要求13所述的方法，其中MgCl₂的濃度低于1.5mM，優選為1.2mM。

15.根據權利要求10-14中任一項所述的方法，其中通過稀釋或滲濾達到低于15mM的合適緩沖液濃度和6.5至8的pH。

16.根據權利要求12或15所述的方法，其中在羥基磷灰石固相層析之后的流穿液中發現目標蛋白質。

17.根據權利要求13-15中任一項所述的方法，其中通過將磷酸根離子濃度增加至15mM以上而將目標蛋白質從羥基磷灰石固相上洗脫下來。

18.根據權利要求17所述的方法，其中所述增加是通過磷酸鹽濃度梯度進行的。