[發明專利]改進的表觀遺傳免疫細胞計數方法

在審

• 申請號: 201880010392.6
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN110382713A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 斯文·歐萊克
• 申請（專利權）人: 艾皮恩蒂斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6881
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

1.血液免疫細胞的定量甲基化測定方法，其包括以下步驟：

a)提供確定量的人血液樣品，其包含待定量的血液免疫細胞的二倍體基因組DNA；

b)提供經計算機模擬的重亞硫酸鹽轉化的重組核酸，其包含至少一個脫甲基化標準基因和所述至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列(“標準物I”)；

c)提供重組核酸，其包含b)所述的至少一個脫甲基化標準基因和b)所述的至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列的脫甲基化的基因組序列(“校準物I”)；

d)提供重組核酸，其包含b)所述的至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列(“標定物I”)；

e)向a)所述的樣品添加確定量的d)所述的重組核酸(“加標”)；

f)利用重亞硫酸鹽處理a)所述的待定量的細胞的二倍體基因組DNA以及c)和d)所述的重組核酸，以將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶；

g)使用適當的引物對擴增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以產生擴增子；以及

h)基于分析所述擴增子確定每體積樣品的血液免疫細胞(BIC)。

2.血液細胞的定量甲基化測定方法，其包括以下步驟：

a)提供人血液樣品，其包含待定量的血液細胞的二倍體基因組DNA；

b)提供經計算機模擬的重亞硫酸鹽轉化的重組核酸，其包含至少一個脫甲基化標準基因和至少一個血液細胞特異性基因(“標準物II”)；

c)提供重組核酸，其包含b)所述的至少一個脫甲基化標準基因和b)所述的至少一個血液細胞特異性基因的脫甲基化的基因組序列(“校準物II”)；

d)利用重亞硫酸鹽處理a)所述的待定量的細胞的二倍體基因組DNA和c)所述的重組核酸，以將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；

e)使用適當的引物對擴增a)、b)、c)和d)所述的核酸分子，以產生擴增子；以及

f)基于分析所述擴增子確定每種所有細胞的脫甲基化百分比(DDC)。

3.確定免疫細胞類型的甲基化基因的絕對拷貝數的方法，其包括：

a)實施權利要求1所述的方法，

b)實施權利要求2所述的方法，以及

c)將所確定的BIC與所確定的DDC相乘。

4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述血液免疫細胞選自：白細胞、T-淋巴細胞、粒細胞、單核細胞、B-淋巴細胞和/或NK細胞。

5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述重組核酸分子選自：質粒、酵母人工染色體(YAC)、人類人工染色體(HAC)、PI來源的人工染色體(PAC)、細菌人工染色體(BAC)和PCR產物。

6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述脫甲基化標準基因選自在待檢測的所有細胞中表達的基因如，例如看家基因，如，例如GAPDH。

7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述血液細胞特異性基因選自在待檢測的所有血液細胞中表達的基因如，例如CD4。

8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述血液樣品選自：外周血、毛細血管血或靜脈血樣品或以上的部分如，例如外周血單核細胞，血塊和干血斑。

9.如權利要求3-8中任一項所述的方法，其還包括基于所述定量推斷哺乳動物的免疫狀態的步驟。

10.診斷試劑盒，其包含用于實施權利要求1-9中任一項所述方法的材料，任選地，以及使用說明書。

11.權利要求10所述的試劑盒用于實施權利要求1-3中任一項所述的方法的用途。