[發明專利]改進的表觀遺傳免疫細胞計數方法

在審

• 申請號: 201880010392.6
• 申請日: 2018-02-08
• 公開（公告）號: CN110382713A
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 斯文·歐萊克
• 申請（專利權）人: 艾皮恩蒂斯有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6881
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本發明涉及改進的表觀遺傳血液和免疫細胞計數方法以及各自的應用和試劑盒。

本發明涉及改進的表觀遺傳血液和免疫細胞計數方法以及各自的應用和試劑盒。

發明背景

偏離細胞免疫系統的生理平衡指示各種疾病，并因此構成了診斷和患者監測的重要度量。目前流式細胞術(FCM)是進行相應測量的最佳方法，其提供了關于待測定的細胞類型的準確性和靈活性(1)。然而，盡管診斷實驗室中使用的血液學分析儀較先進且物流環境廣泛適應所需的流程，但這種方法的適用性有限。

基于FCM的細胞計數需要具有完整白細胞的新鮮、抗凝血或保存良好的血液樣品。即使利用新鮮的樣品，仍建議快速工作，因為分析時間會影響血液抽取后最初幾小時開始的細胞惡化的結果。此外，由于生物學、技術和操作的變化，FCM的標準化仍然是一項重大挑戰(2,3,4,5)，且尚未實現完全標準化的測量(6,7)。然而，最關鍵的挑戰是，并非所有醫療應用都保證可獲得新鮮或保存良好的血液樣品，在這些情況下不能應用流式細胞術。

例如，對HIV感染患者的治療決定取決于患者的CD4⁺T輔助細胞計數。在低于500個T輔助細胞/微升的頻率下，強烈建議進行抗逆轉錄病毒治療，并且在低于200個細胞/微升的水平下是必要的。在資源貧乏的國家，不能頻繁連續進行血液抽取和測量的農村地區，適當的診斷評估常常受到阻礙。因此，通常僅基于HIV相關的臨床癥狀開始治療，這可能導致不理想的結果(8,9)。

另一個實例是新生兒篩查。收集來自腳跟穿刺的Guthrie卡，并用于檢測嚴重的、可治愈的先天性缺陷。這些卡不能用于流式細胞術分析，相反T細胞受體切除環(TREC)被用于PID篩選。TREC分析優先檢測新胸腺遷出細胞(新生兒外周血中主要的T細胞亞型)。然而，該技術僅限于T-(KREC)細胞以及最近的B-(KREC)細胞，但不適合諸如CD4或CD8亞群的鑒別分析，并且也不能檢測其他細胞類型，如NK細胞。因此，新生兒分析中的TREC分析僅用于初步篩查。在治療性造血干細胞移植之前和之后的鑒別診斷和患者監測需要改變技術并且通過流式細胞術進行。

為了克服診斷限制和相關的技術轉換，改進的免疫狀態評估方法將是有價值的。其應當穩健地提供相對和絕對細胞計數，同樣允許使用新鮮的、冷凍的或紙斑點的(paper-spotted)血液。對于每個分析的細胞，信號應該是數字化的，即，每個細胞指示一個正值或負值，而不需要任意定義“陽性”閾值。這樣的新方法同樣應當以自動化的、獨立于操作者的方式進行，并且較少依賴于所使用的試劑如抗體的變化。

在本發明的第一個方面，以上目標通過血液免疫細胞的定量甲基化測定方法得到解決，其包括以下步驟：

a)提供確定量的人血液樣品，其包含待定量的血液免疫細胞的二倍體基因組DNA；

b)提供經計算機模擬的重亞硫酸鹽轉化的重組核酸，其包含至少一個脫甲基化標準基因和所述至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列(“標準物I”)；

c)提供重組核酸，其包含b)所述的至少一個脫甲基化標準基因和b)所述的至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列的脫甲基化的基因組序列(“校準物I”)；

d)提供重組核酸，其包含b)所述的至少一個脫甲基化標準基因的所有CpG二核苷酸倒置為GpC的序列(“標定物I”)；

e)向a)所述的樣品添加確定量的d)所述的重組核酸(“加標”)；

f)利用重亞硫酸鹽處理a)所述的待定量的細胞的二倍體基因組DNA以及c)和d)所述的重組核酸，以將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶；

g)使用適當的引物對擴增a)、b)、c)和f)所述的核酸分子，以產生擴增子；以及

h)基于分析所述擴增子確定每個體積樣品的血液免疫細胞(BIC)。