[發明專利]單細胞人多潛能干細胞的傳代和收獲制劑

在審

• 申請號: 201880007148.4
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN110291189A
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: J·A·羅利;Y·聶;T·費爾納;P·沃爾什;B·艾哈曼迪巴格巴德拉尼
• 申請（專利權）人: 隆薩沃克斯維爾股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/0775
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 余穎;錢文宇

本發明的領域是細胞和分子生物學以及干細胞。具體地，本公開涉及用于收獲和傳代單細胞人多潛能干細胞的制劑，所述制劑包含：(i)1mM至約30mM檸檬酸鈉；(ii)包含10mM至170mM KCl或NaCl的鹽；和(iii)不含Ca2+/Mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)，其中所述制劑具有約100mOsmol/升至約350mOsmol/升的滲透壓。該制劑可以用于連續傳代和移出附著于2D組織培養容器或生長于3D懸浮培養物(小規模和大規模生物反應器)的多潛能干細胞，或其中需要以單細胞干細胞群傳代的任何其他應用。

技術領域

本發明的領域是細胞和分子生物學以及干細胞。具體地，本公開涉及用于收獲和傳代單細胞干細胞(例如，人多潛能干細胞)的制劑，所述制劑包括：(i)1mM至約30mM檸檬酸鈉；(ii)含有10mM至170mM KCl或NaCl的鹽；和(iii)不含Ca2+/Mg2+的杜氏磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)，其中所述制劑具有約100mOsmol/升至約350mOsmol/升的滲透壓(osmolarity)。

背景技術

人多潛能干細胞(hPSC)包括人胚胎干細胞(hESC)和誘導型多潛能干細胞(iPSC)可以在培養中無限增殖，同時保持分化成多種類型的體細胞的能力。這些細胞是非常重要的，因為它們在細胞療法和再生醫學中提供無限的細胞來源。最近FDA批準臨床試驗證明，基于人胚胎干細胞(hESC)的細胞療法正在從實驗室向臨床發展。然而，當前可用的傳統組織培養瓶和基于T型瓶的培養平臺嚴重限制了hPSC生產的可放大性。為了釋放hPSC在細胞治療和再生醫學中的潛力，必須開發可放大的hPSC制造工藝。擴大現有基于燒瓶的工藝是將當前的hPSC研究轉化為臨床應用的關鍵步驟。最大的挑戰之一是為大規模3D懸浮培養或多層容器建立可放大的傳代方法，以保持高產量，多潛能表型和核型穩定性。

人PSC細胞在傳代過程中可以經個體化，即成為單細胞而不是簇，以實現均勻分布和統一處理，用于懸浮培養物中的成像、細胞分選和/或細胞聚集物形成。細胞回收和細胞數量以及活力(viability)對于這些過程的成功至關重要。已經開發了各種制劑(例如，酶促解離方法)以在進行單細胞傳代時實現最大的細胞活力。然而，hPSC個體化(即，制成單細胞)后存活不佳，因為這些細胞對處理更加敏感并且易于細胞死亡，這使得通用解離方法的研發變得特別具有挑戰性。最重要的是，已知一些現有的單細胞解離方法(例如，酶促解離)將影響細胞特征或細胞的遺傳穩定性，因為其在處理過程中從細胞表面剝離重要的細胞粘附和細胞-細胞相互作用介導物。培養條件的質量對hPSC的維持和擴增也是至關重要的。與飼養細胞或動物產品相關的介質成分通常極大地影響細胞培養的一致性，當細胞在轉化研究中具有潛在應用時這可能將更成問題。

如同用于傳代簇的傳統方法，單細胞hPSC的傳代通常基于細胞存活和/或敏感性來選擇。傳統上，hPSC通常用酶促解離以聚集物傳代，對飼養細胞上的培養物使用膠原酶(Thomson JA,等,Science.282:1145–1147(1998)；Reubinoff BE,等,Nat Biotechnol.18:399–404(2000))，而無飼養細胞上的培養物體使用分散酶(Dispase)(Ludwig TE,等,NatMethods.3:637–646(2006))。還開發了機械方法如細胞刮除器和其他傳代工具以解離作為聚集物的細胞。這些過程是勞動密集型的，并且不適用于在多層細胞培養容器中培養hPSC，所述多層細胞培養容器是廣泛用于生產商業規模的貼壁細胞的平臺。多層細胞培養容器中生長的細胞不能進行刮擦。此外，機械刮擦可能會對細胞造成嚴重損害。沒有刮擦的情況下，細胞活力可以增加高達90％。