[發(fā)明專利]可變區(qū)序列文庫構(gòu)建方法、測序方法及其試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880000622.0
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN109415768B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許林浩;黃智敏
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州合諧醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及可變區(qū)序列文庫構(gòu)建方法、測序方法及其試劑盒。本發(fā)明公開了一種可變區(qū)序列文庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟：步驟一、獲得含有編碼可變區(qū)的DNA樣本；步驟二、以所述DNA樣本作為模板，通過第一引物群擴(kuò)增編碼所述可變區(qū)的DNA序列，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物庫；步驟三、以所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物庫作為模板，通過第二引物群和第一接頭的引物擴(kuò)增編碼所述可變區(qū)的DNA序列，獲得可變區(qū)序列組合產(chǎn)物。本發(fā)明用于解決目前構(gòu)建TCR或者BCR的可變區(qū)序列文庫技術(shù)存在的擴(kuò)增效率低、擴(kuò)增存在偏倚性以及容易丟失可變區(qū)序列文庫序列信息的技術(shù)缺陷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及可變區(qū)序列文庫構(gòu)建方法、測序方法及其試劑盒。本申請要求2018年5月30日提交的PCT(國際申請?zhí)枮镻CT/CN2018/088989)的權(quán)益，在此將上述申請的全部內(nèi)容引用并入本文。

背景技術(shù)

“免疫”是人體極其重要的自衛(wèi)功能，依靠自身的免疫力，能抵御種類龐大的各種疾病，幾乎人體內(nèi)所有的疾病都與免疫息息相關(guān)。人體微環(huán)境內(nèi)負(fù)責(zé)保衛(wèi)機(jī)體的免疫細(xì)胞主要有T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等，這些專職免疫細(xì)胞具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，并含有獨(dú)特的免疫細(xì)胞亞群和功能分子。T細(xì)胞和B細(xì)胞是人體主要的淋巴細(xì)胞，分別負(fù)責(zé)細(xì)胞免疫和體液免疫，深入了解T細(xì)胞和B細(xì)胞的組成有助于對疾病的理解、預(yù)防與治療。T細(xì)胞受體(TCR)和B細(xì)胞受體(BCR)是由多條肽鏈組成，具有抗原結(jié)合特異性，每條肽鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(又稱超變區(qū))的氨基酸組成和排列順序呈現(xiàn)高度多樣性，構(gòu)成容量巨大的TCR庫和BCR庫，研究表明亞型越多，越能有效抵抗細(xì)菌、病毒等病原體侵襲，亞型越少越容易感染疾病。另外年齡、環(huán)境、疾病誘發(fā)因素以及用藥等也影響著免疫細(xì)胞的多樣性。由此，免疫組庫測序(Immune Repertoire sequencing，簡稱為IR-SEQ)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生：它是以多重PCR或5′RACE技術(shù)目的擴(kuò)增CDR區(qū)，在結(jié)合高通量測序，從DNA或者RNA水平專門研究TCR和BCR的互補(bǔ)決定區(qū)的免疫多樣性，用于深入挖掘免疫組庫與疾病的關(guān)聯(lián)。

目前從DNA水平進(jìn)行TCR、BCR互補(bǔ)決定區(qū)的免疫多樣性檢測，主要是利用組成TCR、BCR的CDR區(qū)的V基因以及J基因片段進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，進(jìn)行CDR區(qū)的擴(kuò)增，然后這部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行加接頭，在二代測序進(jìn)行TCR和BCR多樣性的檢測。另外一部分研究是從RNA水平進(jìn)行TCR、BCR互補(bǔ)決定區(qū)的免疫多樣性檢測，主要是利用TCR、BCR的CDR區(qū)的末端C區(qū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，延伸至CDR區(qū)的V區(qū)端，然后進(jìn)行產(chǎn)物的擴(kuò)增，并進(jìn)行二代測序，分析TCR、BCR多樣性。

然而，現(xiàn)有的TCR和BCR多樣性的檢測的技術(shù)仍存在以下問題，首先，利用DNA進(jìn)行多重PCR對TCR、BCR的CDR區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，主要存在的問題有，首先是CDR區(qū)兩端的V，J非常多樣，可能每端需要的引物組為幾個(gè)引物到幾十個(gè)引物，取決于引物的設(shè)計(jì)。成套的引物對進(jìn)行擴(kuò)增，因?yàn)閮啥说囊锝M引物多，容易發(fā)生模板上引物不匹配，擴(kuò)增效率相對較低，而一旦形成了主要的擴(kuò)增子，則容易引起擴(kuò)增偏倚性。另外一方面，由于二代測序本身的屬性，容易在測序過程中引入錯(cuò)誤，而目前的多重PCR方案并不能進(jìn)行校正分析，對于多樣性的檢測往往帶來很大的偏差。其次，利用RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR對TCR、BCR的CDR區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增也同時(shí)存在著一些問題，RNA樣本的處理難度相比DNA的樣本更加的困難，且不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解，在樣本處理這一環(huán)節(jié)，已經(jīng)是更加的容易丟失多樣性信息。同時(shí)，目前有些方案的逆轉(zhuǎn)錄方案需要在延伸最后一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行接頭轉(zhuǎn)換，但是現(xiàn)有的接頭轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)換技術(shù)的轉(zhuǎn)換率較低，如果不能成功進(jìn)行接頭轉(zhuǎn)換，則在后續(xù)的環(huán)節(jié)中，該部分信息丟失，同樣對于多樣性結(jié)果有較大的偏差。此外，因?yàn)槊恳粋€(gè)T細(xì)胞或者B細(xì)胞對應(yīng)一個(gè)特有的TCR或者BCR，而RNA樣本有可能在一個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行了大量的轉(zhuǎn)錄，無法實(shí)現(xiàn)每一個(gè)T細(xì)胞或者B細(xì)胞對應(yīng)一個(gè)特有的TCR或者BCR的對應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，研發(fā)一種高效擴(kuò)增，無偏倚性，分析結(jié)果準(zhǔn)確，可以全面構(gòu)建TCR或者BCR的可變區(qū)序列文庫的技術(shù)方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容