[發明專利]可變區序列文庫構建方法、測序方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201880000622.0
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN109415768B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 許林浩;黃智敏
• 申請（專利權）人: 廣州合諧醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張春水;唐京橋

1.一種可變區序列文庫的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、獲得含有編碼可變區的DNA樣本；

步驟二、以所述DNA樣本作為模板，通過第一引物群延伸編碼所述可變區的DNA序列，獲得第一擴增產物庫，其中，所述第一引物群包括特異性識別J區的所有亞型的編碼序列的第一引物，所述第一引物包括特異性識別J區的編碼序列的核苷酸序列、校對隨機段和第一接頭，且所述特異性識別J區的編碼序列的核苷酸序列、所述校對隨機段和所述第一接頭依次連接，所述第一引物群的校對隨機段的序列互不相同；

步驟三、以所述第一擴增產物庫作為模板，通過第二引物群和第一接頭的引物擴增編碼所述可變區的DNA序列，獲得可變區序列組合產物，其中，所述第二引物群包括特異性識別V區的所有亞型的編碼序列的的第二引物；所述第二引物包括特異性識別V區的編碼序列的核苷酸序列和第二接頭，且所述特異性識別V區的編碼序列的核苷酸序列和所述第二接頭相互連接；所述第一接頭的引物包括特異性識別第一接頭的核苷酸序列；

步驟四、以所述可變區序列組合產物為模板，通過第一測序接頭和第二測序接頭擴增編碼所述可變區的DNA序列，獲得可變區序列文庫，其中，所述第一測序接頭包括特異性識別所述第一接頭的核苷酸序列和測序用接頭，所述第二測序接頭包括特異性識別所述第二接頭的核苷酸序列和測序用接頭，所述第一測序接頭的核苷酸序列為SEQ ID NO：86所示，所述第二測序接頭的核苷酸序列為SEQ ID NO：87所示；

所述編碼可變區的DNA樣本為T細胞受體的序列或B細胞受體的序列；

所述編碼可變區的DNA樣本為T細胞受體的序列，所述第一引物群的核苷酸序列如SEQID NO：1-13所示，所述第二引物群的核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：14-65所示；

所述編碼可變區的DNA樣本為B細胞受體的序列，所述第一引物群的核苷酸序列如SEQID NO：66-71 所示，所述第二引物群的核苷酸序列如SEQ ID NO：72-85所示。

2.根據權利要求1所述的可變區序列文庫的構建方法，其特征在于，所述延伸具體包括：變性98℃，40s；延伸60℃，2 min；終延伸72℃，2 min；1個循環。

3.根據權利要求1所述的可變區序列文庫的構建方法，其特征在于，所述步驟三的擴增為多重PCR。

4.根據權利要求3所述的可變區序列文庫的構建方法，其特征在于，所述多重PCR具體包括：預變性95℃，15s；變性94℃，40s；退火60℃，4min；延伸72℃，90s；終延伸72℃，10s；35個循環。

5.根據權利要求1所述的可變區序列文庫的構建方法，其特征在于，所述含有編碼可變區的DNA樣本為從動物外周血中提取的全基因組DNA。