[發明專利]一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法

有效

• 申請號: 201811655139.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109609425B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 廖東慶;孫健;李麗;李昌寶;周主貴;劉國明;楊瑩;李杰民;鄭鳳錦;盛金鳳;何雪梅;零東寧;辛明;李志春;唐雅園;易萍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/65;C12N15/56;C12R1/125
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韋玲雙

本發明具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法。步驟是：1)構建抗性基因整合質粒，轉化枯草芽孢桿菌，篩選得到整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌；2)構建外源基因整合質粒；3)外源基因整合質粒轉化步驟1)獲得的枯草芽孢桿菌，以整合位點的酶可酶解利用的物質的瓊脂固體培養基作為篩選培養基，通過抗生素抗性失活、整合位點的酶活性，篩選出外源基因整合質粒通過同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌的重組工程菌。本發明優點是：不需要抗生素抗性基因作為重組枯草芽孢桿菌的篩選標記；獲得的重組枯草芽孢桿菌保持整合位點的酶活性。

【技術領域】

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法。

【背景技術】

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是非致病的，不產毒素和致熱致敏蛋白質，是一種食品安全的菌種(GRAS：Generally Recognized as Safe)，被歸為食品級微生物范疇。而且枯草芽孢桿菌作為表達系統，具有以下優點：1.具有很強的蛋白質分泌功能，不需要破碎細胞來提取蛋白質，只需要較簡單地處理發酵上清液即可得到較純的目標蛋白質，目前已有多種外源蛋白在枯草芽孢桿菌中實現了分泌表達。2.沒有明顯的密碼子偏愛性，同時表達產物也不容易形成包函體。3.發酵條件簡單。開發利用枯草芽孢桿菌作為表達系統具有深遠的意義。

根據所采用載體的類型不同，枯草芽孢桿菌表達模式可分為可復制質粒表達和染色體整合表達。通常這兩種表達模式都需要抗生素抗性基因來篩選。另外，復制質粒通常在枯草芽孢桿菌中不是很穩定，一般在生產過程中需要使用抗生素，而抗菌活性是食品用酶制劑的重要檢驗要求。此外，研究人員發現，基因工程食物中存在的抗生素抗性基因能轉移到人體腸道微生物中的細菌內?，F在已有一些國家政府為了避免這種基因污染，已明確規定，禁止制作和出售任何抗生素抗性基因的基因工程食物。

目前使用的整合質粒中，大都是以抗性基因作為篩選標記，而且，如果通過同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組，會使整合位點的酶失活。例如整合位點為α-淀粉酶基因的質粒pDG364、pMLK83、pDG1661、pDG1662、pDG1728、pDG1730、pDL、pDK、pSG1154、pSG1192、pSG1193、pSG1729、pSG1190、pSG1191同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組，需要用氯霉素、新霉素或狀觀霉素等抗生素篩選出重組菌，并且獲得的枯草芽孢桿菌重組菌的α-淀粉酶失活；整合位點為thrC基因的質粒pDG1663、pDG1664、pDG1729、pDG1731同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組，需要用紅霉素或狀觀霉素篩選出重組菌，并且獲得的枯草芽孢桿菌重組菌的thrC酶失活；而整合位點為β-半乳糖苷酶基因的質粒pAX01、pA-spac同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌染色體基因組，需要用紅霉素抗生素篩選出重組菌，并且獲得的枯草芽孢桿菌重組菌的β-半乳糖苷酶失活。

【發明內容】

本發明的目的是提供一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法。涉及一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法。步驟是：1)構建抗性基因整合質粒，轉化枯草芽孢桿菌，篩選得到整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌；2)構建外源基因整合質粒；3)外源基因整合質粒轉化步驟1)獲得的枯草芽孢桿菌，以整合位點的酶可酶解利用的物質的瓊脂固體培養基作為篩選培養基，通過抗生素抗性失活、整合位點的酶活性，篩選出外源基因整合質粒通過同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌的重組工程菌。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法，具體步驟是：

(1)構建抗性基因整合質粒，轉化枯草芽孢桿菌，篩選得到整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌作為宿主菌，具體操作如下：