[發明專利]一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法

有效

• 申請號: 201811655139.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109609425B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 廖東慶;孫健;李麗;李昌寶;周主貴;劉國明;楊瑩;李杰民;鄭鳳錦;盛金鳳;何雪梅;零東寧;辛明;李志春;唐雅園;易萍
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/65;C12N15/56;C12R1/125
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 韋玲雙

1.一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法，其特征在于，具體步驟是：

（1）構建抗性基因整合質粒，轉化枯草芽孢桿菌，篩選得到整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌作為宿主菌，具體操作如下：

S1、構建使整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的抗性基因整合質粒，該整合質粒的同源雙交換的DNA序列為A-ARG-C；

其中，A表示上游同源臂，是枯草芽孢桿菌整合位點的酶基因5′端的一段DNA序列；

C表示下游同源臂，是整合位點的酶基因終止密碼子后的一段DNA序列；

同源臂間的ARG為抗生素抗性基因；

S2、篩選整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌：線性化的抗性基因整合質粒轉化枯草芽孢桿菌，在含抗生素的固體培養基上培養、篩選，通過抗生素抗性及整合位點的酶失活，得到整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌；

（2）構建外源基因整合質粒，其中同源雙交換的DNA序列為AB-EGEU-C；

其中，AB是枯草芽孢桿菌整合位點的酶基因的完整序列；

C表示下游同源臂，是整合位點的酶基因終止密碼子后一段DNA序列；

同源臂間的EGEU為外源基因表達單元；

（3）篩選外源基因整合到枯草芽孢桿菌整合位點的枯草芽孢桿菌：線性化的外源基因整合質粒轉化整合位點的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢桿菌，以整合位點的酶可酶解利用的物質的瓊脂固體培養基作為篩選培養基，通過抗生素抗性失活、整合位點的酶活性，篩選出外源基因整合質粒通過同源雙交換整合到枯草芽孢桿菌的重組工程菌。

2.根據權利要求1所述一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168衍生菌株，所述枯草芽孢桿菌168衍生菌株為1A751，WB600和WB800。

3.根據權利要求1所述一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法，其特征在于，

所述的整合位點的酶為枯草芽孢桿菌α-淀粉酶；

所述的DNA序列AB是枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因的完整序列，由AmyS/AmyA引物擴增而得；所述AmyS引物的序列為： 5′-TTCGACGTCTCAAATAAGGAGTGTCA -3′；AmyA引物的序列為：5′-TAGGAGCTCCCTCAATGGGGAAGAGA -3′；

所述的DNA序列A為枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因5′端的一段DNA序列，含DNA序列A的質粒片段由含枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因的完整序列的質粒pUC1ABC經PstⅠ酶切、純化而得；

所述的DNA序列C為枯草芽孢桿菌α-淀粉酶基因終止密碼子后的一段DNA序列，由AEndS/AEndA引物擴增而得；所述AEndS引物的序列為：5′- AGGAAGCTTGGGACTTACCGAAAGAA-3′；所述AEndA引物的序列為： 5′-AATCAGCTGCTGCTTCCAACAAAACC -3′；

所述的抗生素抗性基因ARG為新霉素抗性基因、狀觀霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、紅霉素抗性基因中的一種；

在步驟S2中所述含抗生素的固體培養基為含新霉素20ug/mL的LB固體培養基，或含狀觀霉素100ug/mL的LB固體培養基，或含氯霉素5ug/mL的LB固體培養基，或含紅霉素0.5ug/mL的LB固體培養基；

在步驟（3）中所述可酶解利用的物質的瓊脂固體培養基為僅含有可溶性淀粉的瓊脂固體培養基。

4.根據權利要求1所述一種利用枯草芽孢桿菌整合位點的酶的活性恢復篩選整合重組子的方法，其特征在于，

所述的整合位點的酶為枯草芽孢桿菌蔗糖酶；

所述的DNA序列AB是枯草芽孢桿菌蔗糖酶基因的完整序列，由InvS/InvA引物擴增而得；所述InvS引物的序列為： 5′-GAGGACGTCATGACAGCACATGACCAGGA -3′；所述InvA引物的序列為：5′-TAGGAGCTCTTTCTACATAAGTGTCCAAATTCC -3′；

所述的DNA序列A為枯草芽孢桿菌蔗糖酶基因5′端的一段DNA序列，由InvS/InvP引物擴增而得；所述InvS引物的序列為： 5′-GAGGACGTCATGACAGCACATGACCAGGA -3′；所述InvP引物的序列為： 5′-CAACTGCAGCCCGCTTCCAATTCACA -3′；

所述的DNA序列C為枯草芽孢桿菌蔗糖酶基因終止密碼子后的一段DNA序列，由IEndS/IEndA引物擴增而得；所述IEndS引物的序列為： 5′- CCTCTGCAGTTCTTATGTGAAATCTGAGC -3′；所述IEndA引物的序列為： 5′- AATAAGCTTTTGCAGATTTCCTCAAA -3′；

所述的抗生素抗性基因ARG為新霉素抗性基因、狀觀霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、紅霉素抗性基因中的一種；

在步驟S2中所述含抗生素的固體培養基為含新霉素20ug/mL的LB固體培養基，或含狀觀霉素100ug/mL的LB固體培養基，或含氯霉素5ug/mL的LB固體培養基，或含紅霉素0.5ug/mL的LB固體培養基；

在步驟（3）中所述可酶解利用的物質的瓊脂固體培養基為僅含有蔗糖的瓊脂固體培養基。