[發明專利]一種皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法

在審

• 申請號: 201811654829.8
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109468271A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 萬陽;李小杏;王亮
• 申請（專利權）人: 廣州暨大美塑生物科技有限公司;廣州益養生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法。該方法采用少量多次加液方式，使小組織塊也能達到優良的貼壁效果；使用自主研發的成纖維細胞選擇性培養基，使成纖維原代細胞快速爬出生長，純度在95％以上；發明人還提供了一種純化成纖維細胞的培養方法，可以將成纖維細胞純度提高到99％。本發明提供的方法可大大減小皮膚組織塊提供者創傷面積，有效縮短成纖維原代細胞培養時間，對組織塊傷害小，可以穩定進行多次成纖維細胞原代培養，操作簡便。本發明不僅適用于人和小鼠等皮膚組織塊成纖維原代細胞培養，也適用于臍帶來源、胎盤來源干細胞、癌旁組織等原代細胞培養，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法。

背景技術

成纖維細胞是人真皮結締組織中最常見的細胞，它可以合成膠原蛋白和彈性蛋白，構成皮膚組織的結構框架；可合成細胞外的纖維、基質和蛋白多糖，為新生的血管和增生的細胞提供支架；能促進軟組織的強化作用和促進組織的再生作用；可以為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)細胞技術的研究提供種子細胞等。如何從皮膚組織中分離獲得足夠數量且具有很好活力的成纖維細胞是以上研究的關鍵步驟。

目前，皮膚成纖維細胞的分離培養方法主要有兩類：酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法利用胰蛋白酶、膠原酶等對皮膚組織進行消化，去除組織表皮后，進行離心、重懸和培養，得到皮膚成纖維細胞；該方法可以把單個細胞從組織塊中分離出來，在短時間內爬出純度較高的成纖維細胞，但操作較為繁瑣，對操作員要求較高，并且膠原酶對細胞存在不利影響，導致細胞的貼壁率低，活性不高。組織塊法是將皮膚組織塊直接接種于培養皿中進行培養，該方法操作簡單，但組織塊貼壁率較低，成纖維細胞爬出較慢，一般5～7天方有單細胞游出，20天以上才可進行傳代，并且細胞純度低。

本發明提供了一種皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法。該方法在常規組織塊貼壁法的基礎上，加以優化改良：采用少量多次加液方式，使小組織也能達到優良的貼壁效果；同時使用自主研發的成纖維細胞選擇性培養基，使成纖維原代細胞快速爬出生長，且純度在95％以上；在此基礎上，發明人還提供了一種純化成纖維細胞的培養方法，可將細胞純度提高到99％。本發明提供的方法可大大減小皮膚組織塊提供者創傷面積，有效縮短成纖維原代細胞培養時間，對組織塊傷害小，可以穩定進行多次成纖維細胞原代培養，操作簡便，實用性強，因此本發明在成纖維原代細胞培養及其應用等方面具有廣闊的應用前景。本發明不僅適用于人和小鼠等皮膚組織塊成纖維原代細胞培養，同時也適用于臍帶來源干細胞、胎盤來源干細胞、癌旁組織等原代細胞培養。

發明內容

為了解決現有技術中存在的種種缺陷，本發明在常規組織塊貼壁法的基礎上，加以優化改良，旨在提供一種操作簡單的皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法，在保證細胞活率高的同時，有效提高貼壁率，縮短從皮膚組織獲得穩定高純度成纖維細胞所需要的原代培養時間。具體地，本發明提供了以下技術方案，以實現上述目的：

第一方面，本發明提供了一種皮膚組織來源成纖維細胞快速分離培養方法，包括以下步驟：

步驟(1)：先用碘酒或酒精擦拭取皮區皮膚消毒，用活檢取樣器、手術刀或其他工具擇一取皮膚組織塊，取皮方式按照“活檢取樣法”或手術取樣的標準流程操作將取下的皮膚組織塊浸泡于組織塊保存液(或含雙抗的PBS、生理鹽水)中；

步驟(2)：將浸泡后皮膚組織塊轉移至含雙抗的PBS(或生理鹽水)中洗滌5～8遍，以在分離細胞前洗去血絲，并防止污染；

步驟(3)：修剪皮膚組織并去除皮下組織、脂肪及殘留毛細血管，把皮膚組織剪切成小塊；

步驟(4)：將皮膚組織塊轉移至培養皿里，加選擇性培養基潤濕組織塊，使組織塊不易干燥，并促進成纖維細胞爬出。放置37℃，5％CO₂培養箱靜置1～2h。期間不可移動培養皿。