[發(fā)明專利]一種皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811654829.8
• 申請(qǐng)日: 2018-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN109468271A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 萬陽;李小杏;王亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州暨大美塑生物科技有限公司;廣州益養(yǎng)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/077
• 分類號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)：用活檢取樣器、手術(shù)刀或其他工具擇一取皮膚組織塊，將取下的皮膚組織塊浸泡于組織塊保存液(或含雙抗的PBS、生理鹽水)中；

步驟(2)：將皮膚組織塊轉(zhuǎn)移至含雙抗的PBS(或生理鹽水)中洗滌5～8遍；

步驟(3)：修剪皮膚組織并去除皮下組織、脂肪，把皮膚組織剪切成小塊；

步驟(4)：將皮膚組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿里，加一滴選擇性培養(yǎng)基潤(rùn)濕組織塊，放置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱靜置1～2h；

步驟(5)：將裝有皮膚組織塊的培養(yǎng)皿取出，補(bǔ)加選擇性培養(yǎng)基至沒過組織塊，放置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

步驟(6)：三天更換一次新鮮選擇性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，直至獲得皮膚成纖維原代細(xì)胞；

步驟(7)：獲得皮膚成纖維原代細(xì)胞后，更換含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例更高的選擇性培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)80％～90％時(shí)，即進(jìn)行消化傳代。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)至(7)中所述的皮膚組織塊為人皮膚組織塊、動(dòng)物皮膚組織塊。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)至(7)中所述的組織塊培養(yǎng)方法同時(shí)適用臍帶來源干細(xì)胞、胎盤來源干細(xì)胞、癌旁組織等原代細(xì)胞培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的組織塊保存液組成為含雙抗的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(4)至(6)的加液方法為少量多次，具體為：將皮膚組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿里，加入1～2滴選擇性培養(yǎng)基潤(rùn)濕組織塊，防止組織塊干燥，放置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱靜置1～2h，期間不可移動(dòng)培養(yǎng)皿。然后，將裝有皮膚組織塊的培養(yǎng)皿取出，補(bǔ)加選擇性培養(yǎng)基至剛好沒過組織塊。之后每3天更換一次新鮮選擇性培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的選擇性培養(yǎng)基為含有雙抗、促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因子、血清或血清替代物擇一的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述選擇性培養(yǎng)基組成為：含1％～2％雙抗、0.001％～0.003％促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因子、10％～15％血清或血清替代物的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(1)至(7)中所述的雙抗優(yōu)選為青霉素-鏈霉素溶液，其含量?jī)?yōu)選為1％。

8.一種純化成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.根據(jù)權(quán)利要求1～7中所述的皮膚組織來源成纖維細(xì)胞快速分離培養(yǎng)方法制得成纖維原代細(xì)胞；

b.待步驟a中制得的皮膚成纖維原代細(xì)胞的匯合度達(dá)到80％后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)：先把培養(yǎng)液上清棄去，用PBS洗滌成纖維原代細(xì)胞，把PBS棄去，用質(zhì)量百分比濃度為0.05％～0.3％的胰蛋白酶液進(jìn)行消化，快速輕拍或用吸管等吹打培養(yǎng)皿壁使細(xì)胞脫落；接著加入新鮮選擇性培養(yǎng)基停止消化，把細(xì)胞懸液吸出，得到成纖維細(xì)胞；

c.離心，棄上清，用選擇性培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種到新培養(yǎng)皿培養(yǎng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，其特征在于步驟b中所述的胰蛋白酶液優(yōu)選為質(zhì)量百分比濃度為0.25％。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的純化成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法中，其特征在于，所述的選擇性培養(yǎng)基為含有促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因子、血清或血清替代物擇一的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述選擇性培養(yǎng)基組成為：含0.001％～0.003％促成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的因子、10％～15％血清或血清替代物的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。