[發明專利]一種基于LAG-3/MHC II阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法

有效

• 申請號: 201811653923.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109666699B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 范春雷;吳王親;武虎;匡紅;劉美星;莫一平
• 申請（專利權）人: 杭州科興生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12Q1/02;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 北京工信聯合知識產權代理有限公司 11266
• 代理人: 商琛

本發明建立了一種基于LAG?3/MHC II阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法：將紅色熒光蛋白tagRFP偶聯于LAG?3蛋白羧基末端末端(C端)，以及LAG?3蛋白胞外域(1?451aa)羧基末端(C端)，分別構建真核表達載體，并制備LAG?3?tagRFP及LAG?3ex?tagRFP融合蛋白；將人源MHC II蛋白基因構建在CMV啟動子下，綠色熒光蛋白EGFP建在人工復合調控元件E?Box_AP?1_CRE序列下，并建立新型的穩轉細胞系MHC II.E?Box_AP?1_CRE?d2EGFP/A375，以LAG?3?tagRFP或LAG?3ex?tagRFP與細胞系的親和進行熒光檢測篩選阻斷劑。本方法可精確反映抗LAG?3藥的效應，可同時獲得阻斷功能與LAG?3/MHC II信號通路的生物學效應數據，構建快速篩選抗LAG?3藥物和評估其生物學效應的實驗模型。

技術領域

本發明涉及一種基于Lag-3/MHCII靶點及其生物效應的藥物快速篩選方法，屬于生物技術領域。

背景技術

淋巴細胞活化基因-3(Lymphocyte activation gene 3，LAG-3)主要表達于活化的 T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)和漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cells，PDCs)，與主要組織相容性復合體II類分子(majorhistocompatibility complex class Il，MHC II)具有高親和力，通過對T細胞活化的負調控參與免疫調節。

LAG-3顯著表達在霍奇金淋巴瘤的里-斯細胞(Hodgkin/Reed-Sternberg cell，HRS)豐富的區域。淋巴細胞浸潤的黑素瘤轉移淋巴結不僅包含表達LAG-3的T細胞，也包含較高比例的表達LAG-3的NKT和NK細胞。黑素瘤細胞上MHC II能和 T細胞上LAG-3相互作用。LAG-3也可以活化MHC II陽性的黑色素瘤細胞的絲裂素活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(mitogen-activated protein kinase/ extracellular signal regulated kinase，MAPK/Erk)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase/proteinkinase B，P13K/Akt)信號通路。不論可溶性 LAG-3還是細胞膜上表達的LAG-3，都能保護MHCII陽性的A375黑素瘤細胞不受 Fas介導的凋亡，也保護MHCII陽性的Mell黑素瘤細胞免于化療藥物依托泊苷介導的凋亡，這些保護作用都和MAPK/Erk和P13K/Akt信號通路有關系。黑色素瘤細胞上LAG-3和MHC II的相互作用正調節MAPK/Erk和P13K/Akt信號通路。因而可利用阻止LAG-3與MHc II相互作用形成復合物作為手段來治療MHCII陽性的黑色素瘤。

基于LAG-3/MHC II阻斷功能的抗癌新藥，包括抗Lag-3單抗藥、小分子阻斷劑、多肽阻斷劑等的研發已是目前醫藥領域熱點之一。但目前為止尚未見有關基于LAG-3/MHC II阻斷功能及其生物效應的新藥快速、高效而精準的篩選系統。

發明內容

本發明的目的是建立了一種基于LAG-3/MHC II阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法。

本發明構思如下：