[發明專利]一種基于LAG-3/MHC II阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法

有效

• 申請號: 201811653923.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109666699B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 范春雷;吳王親;武虎;匡紅;劉美星;莫一平
• 申請（專利權）人: 杭州科興生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12Q1/02;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 北京工信聯合知識產權代理有限公司 11266
• 代理人: 商琛

1.一種基于Lag-3/MHCII阻斷功能及其生物效應的藥物快速篩選方法，包括以下步驟：

1)將第一熒光蛋白與LAG-3蛋白胞外域羧基末端連接，構建重組LAG-3ex-第一熒光蛋白融合蛋白；在第一熒光蛋白的C端連接6個組氨酸His標簽；

2)通過連接肽序列將人源MHCⅡ基因的α亞基與β亞基前后連接在同一個讀碼框里，并將復合基因亞克隆到真核表達載體CMV啟動子下，構建表達質粒；在E-Box_AP-1_CRE人工復合調控元件下連接第二熒光蛋白，構建調控表達報告基因質粒；

將兩個表達質粒分別與慢病毒包裝質粒pH1、pH2共轉染到慢病毒包裝系細胞293V，制備慢病毒，并共轉染A375細胞，篩選克隆建立新型的穩轉細胞系MHCⅡ.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375；

3)將抗Lag-3的單抗藥、小分子、或多肽阻斷劑與重組LAG-3ex-第一熒光蛋白融合蛋白共孵育后再與步驟2)獲得的穩轉細胞系一起共孵育；同時設立步驟2)獲得的穩轉細胞系與重組LAG-3ex-第一熒光蛋白融合蛋白直接共孵育的對照組；

4)清洗非特異性結合后，分別檢測第一、第二熒光蛋白熒光值，并判斷抗Lag-3的單抗藥、小分子、或多肽阻斷劑對Lag-3/MHCⅡ信號通路的阻斷功能；

所述連接肽序列為T2A序列，其蛋白序列為EGRGSLLTCGDVEENPGP。

2.根據權利要求1的藥物快速篩選方法，其中第一熒光蛋白是tagRFP紅色熒光蛋白；第二熒光蛋白是綠色熒光蛋白d2EGFP。

3.根據權利要求2的藥物快速篩選方法，其中步驟1)中，將紅色熒光蛋白tagRFP基因與人LAG-3基因胞外域構建在同一個讀碼框使紅色熒光蛋白tagRFP接于LAG-3蛋白胞外域C端形成所述LAG-3ex-tagRFP融合蛋白基因，同時在tagRFP的C端接上6個組氨酸His標簽。

4.根據權利要求3的藥物快速篩選方法，其中步驟1)中，將LAG-3ex-tagRFP融合蛋白基因克隆至真核高表達載體CMV啟動子下游，并轉染至人胚腎細胞293，篩選獲得高表達LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的LAG-3ex-tagRFP/293細胞系；擴增該LAG-3ex-tagRFP/293細胞，裂解后用His親和法制備純化含可溶性重組LAG-3ex-tagRFP融合蛋白。

5.根據權利要求4的藥物快速篩選方法，其中步驟2)中，

通過連接肽序列T2A將人源MHCII基因的α亞基與β亞基前后連接在同一個讀碼框里，并將復合基因通過EcoR I/Not I亞克隆到慢病毒表達載體pLV-puro的CMV啟動子下，構建表達質粒pCMV-MHC II；將綠色熒光蛋白d2EGFP構建在E-Box_AP-1_CRE人工復合調控元件下，通過Cla I/Not I雙酶切克隆至慢病毒載體pLV-puro，去掉原有的CMV啟動子，構建調控表達報告基因質粒pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP；將pCMV-MHC II和pE-Box_AP-1_CRE-d2EGFP分別與慢病毒包裝質粒pH1、pH2共轉染到慢病毒包裝系細胞293V，制備CMV-MHC II和E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP慢病毒，并共轉染A375細胞，建立穩轉細胞系MHCII.E-Box_AP-1_CRE-d2EGFP/A375；

其中編碼LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:1的第7-2100位所示，表達后LAG-3ex-tagRFP融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

編碼MHCⅡ蛋白的DNA基因序列如SEQ ID NO:3的第7-1611位所示，表達后MHCⅡ蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

人工復合調控元件E-Box_AP-1_CRE的DNA基因序列如SEQ ID NO:5的第1-135位所示。