[發(fā)明專利]一種葡萄糖基轉移酶在生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811653240.6
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109762794B
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發(fā)明（設計）人: 陸躍樂;徐安杰;陳小龍;朱林江;陳翰馳;范永仙
• 申請（專利權）人: 浙江工業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12P19/44;C12P19/18
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種葡萄糖基轉移酶在生產(chǎn)乙基香蘭素?α?D?葡萄糖苷中的應用，所述葡萄糖基轉移酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。所述的應用以含葡萄糖基轉移酶編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液為菌劑，以麥芽糖和乙基香蘭素為底物，在pH值6.0?8.5、20?40℃條件下進行轉化反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得乙基香蘭素?α?D?葡萄糖苷。本發(fā)明的菌劑生物催化生產(chǎn)乙基香蘭素?α?D?葡萄糖苷，底物轉化率大于80％，乙基香蘭素?α?D?葡萄糖苷的產(chǎn)物濃度高，轉化率高，有利于生物法制備乙基香蘭素?α?D?葡萄糖苷回收純化。

(一)技術領域

本發(fā)明涉及一種葡萄糖基轉移酶在生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷中的應用。

(二)背景技術

乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷化學結構式如圖1所示。乙基香蘭素由鄰乙氧基苯酚或黃樟腦油制得，屬廣譜型香料，是當今世界上最重要的合成香料之一，是食品添加劑行業(yè)中不可缺少的重要原料，其香氣是香蘭素的3-4倍，具有濃郁的香莢蘭豆香氣，且留香持久。廣泛用于食品、巧克力、冰淇淋、飲料以及日用化妝品中起增香和定香作用。另外乙基香蘭素還可做飼料的添加劑、電鍍行業(yè)的增亮劑，制藥行業(yè)的中間體。但香蘭素及乙基香蘭素，不管是合成的還是天然的自身均有難以克服的缺點，即穩(wěn)定性差，使用上稍有不當就會失去發(fā)香能力，使被加香物產(chǎn)生會人厭惡的氣味。在香煙中使用常常會壓香，造成滯留。

為了克服這些弱點，本發(fā)明通過轉糖苷酶催化轉化制備乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷的綠色生物法合成工藝，其穩(wěn)定性比之乙基香蘭素更強，避免了在使用上出現(xiàn)的問題。且采用了生物酶法催化，避免了化學合成帶來的嚴重環(huán)境污染和巨大生產(chǎn)安全隱患。采用安全綠色環(huán)保的方法生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷。

(三)發(fā)明內容

本發(fā)明目的是提供一種葡萄糖基轉移酶在生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷中的應用。

本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供一種源自樹蕨黃單胞菌(Xanthomonas arboricola)的葡萄糖基轉移酶在生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷中的應用，所述葡萄糖基轉移酶氨基酸序列為SEQ IDNO.2所示，所述酶編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

進一步，所述的應用以含葡萄糖基轉移酶編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液為菌劑，以麥芽糖和乙基香蘭素為底物，在pH值6.0-8.5、20-40℃條件下進行轉化反應，反應完全后，將反應液分離純化，獲得乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷。所述麥芽糖加入的質量濃度以發(fā)酵液體積計為200-500g/L(優(yōu)選350g/L)，所述乙基香蘭素加入的質量濃度以發(fā)酵液體積計為5-50g/L(優(yōu)選15g/L)，所述發(fā)酵液中濕菌體含量為5-30g/L(優(yōu)選10g/L)。

進一步，本發(fā)明所述菌劑按如下方法制備：將含葡萄糖基轉移酶編碼基因的工程菌接種到含卡那霉素50μg/L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-37℃培養(yǎng)4-6h(優(yōu)選35℃，5h)；再加入終濃度為5.6-7.0mM(優(yōu)選7.0mM)的α-乳糖，22-25℃繼續(xù)發(fā)酵12-18h(優(yōu)選24℃，16h)，取發(fā)酵液，即得到生產(chǎn)乙基香蘭素-α-D-葡萄糖苷的菌劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mM Na₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mMNa₂SO₄、2mM MgSO₄，溶劑為去離子水，pH7.0。