[發(fā)明專利]一種固定化胰蛋白酶的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811647905.2
• 申請(qǐng)日: 2018-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109762805A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 史百鳴;王運(yùn)龍;盧雪峰;李國(guó)瑩;陸瑞琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇一鳴生物股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N11/14
• 分類號(hào): C12N11/14;C12N11/10
• 代理公司: 蘇州國(guó)卓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32331
• 代理人: 明志會(huì)

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種固定化胰蛋白酶的方法，包括將固定材料加入醋酸水溶液中；加入20?30二氧化硅球；將第二溶液滴入氫氧化鈉、乙醇的水溶液中；氫氧化鈉溶液加熱促進(jìn)小球A中的二氧化硅溶解；取出小球B清洗；小球C放入甘油溶液中浸泡；小球D，置于烤箱中烘干；取小球E加入戊二醛溶液修飾表面基團(tuán)，洗滌；將小球F固定、沖洗得到固定化胰蛋白酶。該固定化胰蛋白酶的方法選用的殼聚糖表面有大量的氨基，可在戊二醛的修飾下與酶分子交聯(lián)；二氧化硅與熱堿在殼聚糖小球內(nèi)部產(chǎn)生孔道，增大了載體的比表面積，提高了單位質(zhì)量載體的載酶量；使用的殼聚糖，二氧化硅，戊二醛，氫氧化鈉，醋酸均為化學(xué)大宗商品，價(jià)廉易得。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種固定化胰蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

胰蛋白酶為蛋白酶的一種，EC 3.4.4.4，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶，在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用，在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成后，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用，是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具；隨著生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，作為催化劑的胰蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，胰蛋白酶屬于水溶性蛋白質(zhì)，在溶解狀態(tài)下與底物溶液形成的均相反應(yīng)體系中表現(xiàn)出高的催化活性，但是該酶在溶液中穩(wěn)定性差，容易發(fā)生自消化反應(yīng)，且以溶液狀態(tài)使用智能是一次性的，導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，因而受到了一定限制，為了解決胰蛋白酶在工業(yè)上的應(yīng)用難題，可以將其制備成固化酶使用，現(xiàn)有的固定化胰蛋白酶的技術(shù)主要有以下幾類：1、吸附（利用物理吸附作用將酶分子吸附于載體表面）；2、包埋（胰蛋白酶分子被包埋在載體內(nèi)部）3、交聯(lián)（將胰蛋白酶分子通過(guò)共價(jià)鍵連接到載體表面），但是現(xiàn)有的技術(shù)的缺點(diǎn)也同樣很明顯：吸附-理吸附作用力弱，酶分子固定后容易脫落；包埋-胰蛋白酶的作用底物也是各類蛋白大分子，被包埋的胰蛋白酶難以與底物接觸反應(yīng)；交聯(lián)-要求載體表面有可交聯(lián)的基團(tuán)，且有大的比表面積，所以現(xiàn)在發(fā)明一種既可以實(shí)現(xiàn)成本低廉同時(shí)又可以獲得高酶載量、酶固定牢固的固定化胰蛋白酶方法來(lái)解決以上問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種固定化胰蛋白酶的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

設(shè)計(jì)一種固定化胰蛋白酶的方法，包括以下步驟：

步驟一：選擇固定化胰蛋白酶的材料40-50份，醋酸水溶液50-100份，將固定材料加入醋酸水溶液中，調(diào)至到所需濃度，用高速攪拌機(jī)高速攪拌混勻至形成透明粘稠的均一體系溶液，得到第一溶液，靜置20-30min除去氣泡；

步驟二：在獲得的第一溶液中加入20-30份粒徑為10μm的二氧化硅球，調(diào)制濃度是5%，用攪拌棒慢慢攪拌至小球分散均勻，得到第二溶液，減少氣泡的形成；

步驟三：將第二溶液通過(guò)內(nèi)徑1mm的管道逐滴滴入含12%氫氧化鈉、20%乙醇的水溶液中，滴入的液滴在水溶液中會(huì)逐漸形成白色的小球，剛滴入時(shí)浮在液面處，后逐漸沉入底部，得到小球A；

步驟四：取50-100份的5%氫氧化鈉溶液置于量杯中，并將氫氧化鈉溶液加熱至80℃，用儀器取出小球A置于量杯中，恒溫反應(yīng)2h-4h，促進(jìn)小球A中的二氧化硅溶解，形成孔道，得到小球B；

步驟五：取出小球B將其放入清水中清洗至洗滌液為中性為止，得到小球C；

步驟六：取出小球C放入30%甘油溶液中充分浸泡1h-2h，得到小球D；

步驟七：取一個(gè)烤箱調(diào)節(jié)溫度至40℃，取出小球D，置于烤箱中烘干10h-20h，得到小球E；