[發(fā)明專利]一種適合質(zhì)譜檢測(cè)的樣本前處理組合物、樣本前處理方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811646570.2
• 申請(qǐng)日: 2018-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN111381043B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李艷召;王秀利;王杰;許彬;林長(zhǎng)青
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京舜景生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/543
• 代理公司: 北京悅和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11714
• 代理人: 田昕

本發(fā)明涉及適合質(zhì)譜檢測(cè)的樣本前處理組合物、樣本前處理方法及應(yīng)用，通過(guò)本發(fā)明提供的樣本前處理方法可以準(zhǔn)確分離樣本中的目標(biāo)糖基化蛋白，富集的糖基化蛋白無(wú)需其他處理，可以直接上質(zhì)譜檢測(cè)，為質(zhì)譜檢測(cè)分析提供簡(jiǎn)便的前處理方法，使質(zhì)譜分析儀可以對(duì)腫瘤、自身免疫疾病等相關(guān)疾病進(jìn)行篩查及檢測(cè)，本發(fā)明對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)具有重要意義，具有極高的靈敏度，方法快速簡(jiǎn)便而且易于自動(dòng)化。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)療器械及體外診斷的技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種適合質(zhì)譜檢測(cè)的樣本前處理組合物、樣本前處理方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

質(zhì)譜檢測(cè)(mass spectrometry，MS)的基本原理是：使分子或原子等粒子在離子源中發(fā)生電離，并在加速電場(chǎng)的作用下，讓所發(fā)生電離對(duì)的分子或原子進(jìn)入質(zhì)量分析器，利用電場(chǎng)、磁場(chǎng)使各種離子按質(zhì)荷比發(fā)生色散和聚焦，從而確定其質(zhì)量，并根據(jù)質(zhì)量及圖譜分析確定待測(cè)樣品的類型和數(shù)量。

從20世紀(jì)40年代開始，質(zhì)譜廣泛用于有機(jī)物質(zhì)分析，并相繼出現(xiàn)了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)、場(chǎng)解析(FD)技術(shù)、等離子體解析(PD)技術(shù)、快速原子轟擊(FAB)、熱噴霧(TS)等離子化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜混合物、極性較大的生物分子的分析和鑒定，可分析和鑒定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍達(dá)到了千道爾頓(KDa)級(jí)別及以上。

電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)兩大軟電離技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，使蛋白質(zhì)、核酸和聚糖這樣高極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定、質(zhì)量可高達(dá)幾十萬(wàn)的生物大分子高效、持續(xù)、穩(wěn)定地生成準(zhǔn)分子離子；電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)與離子阱質(zhì)譜分析儀(IT)、三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜分析儀(QQQ)、飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀(TOF)和傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析儀(FTICR)等高性能質(zhì)譜分析器聯(lián)合使用后，可以實(shí)現(xiàn)生物大分子的質(zhì)譜分析、定量分析和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，并且檢出限可達(dá)到皮摩爾級(jí)(ppm)甚至更低。

糖基化是蛋白質(zhì)形成過(guò)程中一種最常見的蛋白翻譯后修飾，人體樣本中50％以上的蛋白都具有糖基化修飾，其對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響。其中兩種主要類型的糖基化為：N-糖基化和粘蛋白型O-糖基化。其中：

1、N-糖基化蛋白的N-糖基化發(fā)生在蛋白特征序列Asn-Xaa-Ser/Thr，即N-X-S/T，糖鏈的還原末端通過(guò)Asn的側(cè)鏈氨基與蛋白質(zhì)相連。N-糖鏈由五糖核心和分支(或天線)兩部分構(gòu)成，其中，五糖核心由兩個(gè)乙酰葡糖胺(GlcNAc)和三個(gè)甘露糖(Man)組成，某些情況下，還原末端的乙酰葡糖胺(GlcNAc)還會(huì)與一個(gè)巖藻糖(Fuc)連接，形成核心巖藻糖結(jié)構(gòu)。五糖核心通常連接2-4條分支，根據(jù)分支類型的不同，N糖基化蛋白細(xì)分為三種亞型，即：高甘露糖型、復(fù)雜型和雜合型。其中：(1)高甘露糖型N糖基化蛋白的糖鏈分支均由甘露糖組成；(2)復(fù)雜型N糖基化蛋白的糖鏈分支由乙酰葡糖胺、半乳糖(Gal)、唾液酸(Sia)等單糖按照特定的順序依次連接而成；(3)雜合型N糖基化蛋白的糖鏈分支同時(shí)含有上述兩種分支。

2、O-糖基化蛋白的O-糖基化發(fā)生在氨基酸殘基Ser/Thr上，糖鏈還原末端與Ser/Thr的側(cè)鏈羥基相連。與N-糖基化蛋白相比，O-糖基化蛋白的糖基化位點(diǎn)不具有保守性的蛋白特征序列，且存在多種核心結(jié)構(gòu)。O-糖基化蛋白的糖鏈的單糖組成較為簡(jiǎn)單，但連接方式和亞型多，因此結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，常見O-糖基化蛋白有以乙酰半乳糖胺(GalNAc)為還原末端的O-糖基化蛋白。

大量研究發(fā)現(xiàn)，異常的糖基化現(xiàn)象往往與疾病密切相關(guān)，包括癌癥和先天性糖鏈缺陷等。糖基化修飾過(guò)程中形成的糖鏈結(jié)構(gòu)異常蛋白已經(jīng)被確定為病毒性疾病、糖尿病、自身免疫疾病、癌癥、遺傳性疾病等疾病的一種標(biāo)志物，它在疾病的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移方面具有重要意義，也為疾病診斷和研究提供了一個(gè)新的診斷方法。目前，已發(fā)現(xiàn)的糖鏈結(jié)構(gòu)異常蛋白包括：用于肝癌的AFP，用于卵巢癌的CA125，用于結(jié)腸癌的CEA和用于前列腺癌的PSA、與聚糖相關(guān)的標(biāo)志物例如CA19-9、轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性磷酸酶、r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、T抗原、a1抗胰蛋白酶、前列腺酸性磷酸酶、結(jié)合珠蛋白、免疫球蛋白IgG、球蛋白A、血漿銅藍(lán)蛋白等。