[發(fā)明專利]人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811642796.5
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109652448B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張洪建;王美玉
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 徐洋洋

本發(fā)明涉及一種人源OAT1?MRP2?UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建方法及功能驗證：將hOAT1的目的基因與pcDNA3.1/Hygro(+)表達載體組裝，hMRP2的目的基因與pcDNA3.1/G418(+)表達載體組裝，hUGT2B7的目的基因與pcDNA3.1/Puromycin(+)表達載體組裝，構(gòu)建pcDNA3.1/Hygro(+)?hOAT1質(zhì)粒、pcDNA3.1/G418(+)?hMRP2質(zhì)粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)?hUGT2B7質(zhì)粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1?3所示；采用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的三種質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)染至MDCKII細胞、Caco2細胞或HEK293細胞，分別使用特異抗生素篩選出陽性克隆，并通過使用陽性化合物進行轉(zhuǎn)運或代謝功能驗證，確認細胞株同時穩(wěn)定表達OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白。本發(fā)明的三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株可用于模擬肝內(nèi)OAT1介導的攝取、MRP2介導的外排及UGT2B7介導的二相代謝功能，是評價藥物處置機制的重要體外研究手段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞株構(gòu)建領(lǐng)域，尤其涉及一種人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建方法及功能驗證。

背景技術(shù)

藥物代謝轉(zhuǎn)運是體內(nèi)藥物處置的關(guān)鍵因素，直接影響藥物的安全性及治療效果。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，建立體外高表達細胞模型日益成為研究藥物處置機制、相互作用以及安全性的首選模型。目前已有報道的研究代謝轉(zhuǎn)運的細胞模型包括Caco2細胞(人結(jié)直腸癌細胞系)、高表達轉(zhuǎn)運體MDCKII細胞模型(如MDCKII-hOCTs、MDCKII-hOATPs、MDCKII-hMDR1、MDCKII-hBCRP、MDCKII-MRP2、MDCKII-hMDR1-hBCRP等)以及HEK293細胞模型(如HEK293-OATP1A2、HEK293-OATP1B1、HEK293-OCT等)。這些細胞模型的建立為闡明藥物代謝機制、研究代謝酶和轉(zhuǎn)運體間的相互作用提供了可能。

近年來，通過建立細胞培養(yǎng)模型來研究藥物處置機制是藥物研發(fā)進程中取得的重要突破與成就。應(yīng)用細胞模型可以研究候選化合物或者臨床用藥的轉(zhuǎn)運機制、代謝、藥物藥物相互作用、毒性以及安全性評估等。細胞模型方法具有所需的藥物量少、實驗方法簡單、分析迅速、環(huán)境條件可控(溫度、pH等)等優(yōu)勢，能夠快速獲得藥物透膜的轉(zhuǎn)運機制，可以達到體外高通量篩選的目的。

在藥物處置及相互作用機制研究中，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株是重要的研究技術(shù)。目前，缺乏一種OAT1-MRP2-UGT2B7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株及其構(gòu)建方法，為后續(xù)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運機制研究工作提供技術(shù)平臺。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)將hOAT1的目的基因與pcDNA3.1/Hygro(+)表達載體組裝，hMRP2的目的基因與pcDNA3.1/G418(+)表達載體組裝，hUGT2B7的目的基因與pcDNA3.1/Puromycin(+)表達載體組裝，構(gòu)建pcDNA3.1/Hygro(+)-hOAT1質(zhì)粒、pcDNA3.1/G418(+)-hMRP2質(zhì)粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)-hUGT2B7質(zhì)粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1-3所示；

(2)采用脂質(zhì)體法將步驟(1)構(gòu)建的三種質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)染至MDCKII細胞、Caco2細胞或HEK293細胞，細胞轉(zhuǎn)染24h后，分別使用特異性抗生素篩選出陽性克隆，并通過使用陽性化合物進行轉(zhuǎn)運或代謝功能驗證，確認細胞株同時穩(wěn)定表達OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白，即構(gòu)建出所述人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，其中，所述抗生素為G418抗生素、hygromycin B抗生素和Puromycin抗生素。