[發明專利]人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩定轉染細胞株及其構建方法

有效

• 申請號: 201811642796.5
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109652448B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 張洪建;王美玉
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 徐洋洋

1.一種人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩定轉染細胞株的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將hOAT1的目的基因與pcDNA3.1/Hygro(+)表達載體組裝，hMRP2的目的基因與pcDNA3.1/G418(+)表達載體組裝，hUGT2B7的目的基因與pcDNA3.1/Puromycin(+)表達載體組裝，構建pcDNA3.1/Hygro(+)-hOAT1質粒、pcDNA3.1/G418(+)-hMRP2質粒和pcDNA3.1/Puromycin(+)-hUGT2B7質粒；其中，hOAT1、hMRP2和hUGT2B7目的基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1-3所示；

(2)采用脂質體法將步驟(1)構建的三種質粒依次轉染至MDCKII細胞、Caco2細胞或HEK293細胞，細胞轉染24h后，用抗生素篩選出陽性克隆，構建出所述人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩定轉染細胞株，其中，所述抗生素為G418、潮霉素B和嘌呤霉素。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(1)中，構建質粒時所采用的內切酶為NheⅠ和KpnⅠ限制性內切酶或NheⅠ和HindⅢ限制性內切酶。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，質粒轉染時，三種質粒的濃度為0.001μg/μL。

4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，所述G418的濃度為800μg/mL，潮霉素B的濃度為400μg/mL，嘌呤霉素的濃度為5μg/mL。

5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，取對數生長期的細胞進行細胞轉染。

6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，抗生素篩選時，細胞融合度超過25％時，立即傳代，每3-4天更換含特定濃度抗生素的培養液進行培養，重復以上步驟，直至傳代至3-4代，挑選出陽性單克隆繼續培養至長成細胞株。

7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，質粒轉染所用培養基為無血清的DEME培養基。

8.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于：在步驟(2)中，采用PolyJet轉染試劑進行質粒轉染。

9.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于：轉染試劑的用量為40μL每100μL培養基。

10.一種權利要求1-9中任一項所述的方法所構建的人源OAT1-MRP2-UGT2B7三重穩定轉染細胞株，其特征在于：細胞株同時穩定表達OAT1、MRP2和UGT2B7基因及其蛋白。