[發明專利]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統敲除小菜蛾APN1基因及其應用

在審

• 申請號: 201811642687.3
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109593762A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 張友軍;郭兆將;孫丹;康師;郭樂;周君雷;龔莉君;覃艦瑩;朱流紅;白楊;羅亮
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種利用CRISPR/Cas9實現非模式生物小菜蛾APN1基因的敲除及其在Bt Cry1Ac殺蟲蛋白抗性機制分子研究中的應用。本發明方法設計并合成小菜蛾APN1基因特異性sgRNA靶標序列，將sgRNA與Cas9蛋白混合后顯微注射到小菜蛾前胚盤期卵后極部位，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統篩選出可穩定遺傳的小菜蛾APN1基因純合突變種群并用于Bt Cry1Ac殺蟲蛋白毒力生物測定，證實小菜蛾APN1基因突變可以導致其對Bt Cry1Ac殺蟲蛋白產生高抗性。本發明方法簡單高效，省時省力，不僅為非模式生物體內功能基因的深入研究提供技術支撐，也為探索新的害蟲防治策略奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及小菜蛾APN1基因的敲除以及在小菜蛾BtCry1Ac殺蟲蛋白抗性分子機制研究中的應用。

背景技術

小菜蛾[Plutella xylostella (L.)]是一種世界性的十字花科作物專食性害蟲，也是目前抗藥性最為嚴重的害蟲之一，其交互抗性譜廣、抗性水平高、發展速度快。并且隨著十字花科蔬菜在各地的廣泛栽培，小菜蛾已對世界十字花科蔬菜的生產造成極大的威脅。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)能產生Cry類殺蟲晶體蛋白，對多種昆蟲具有特異性毒殺作用，是目前世界上用途最廣、產量最大的微生物殺蟲劑，占微生物殺蟲劑總量的95%以上，因其對害蟲高效、對人畜安全、對環境友好而在世界范圍內得到廣泛的應用。小菜蛾是最早被報道在田間對Bt殺蟲劑產生高抗性的害蟲，自從第一例來自美國夏威夷的田間抗性報道以來，在日本、馬來西亞以及我國的深圳、廣州等地區的田間小菜蛾也對Bt 均產生了不同程度的抗性。因此，尋找合理的科學手段研究小菜蛾Bt抗性分子機制，從根本上解決害蟲抗藥性問題就顯得尤為重要。

氨基肽酶N (Aminopeptidase N, APN)屬于一類肽鏈外切酶，廣泛存在于動植物的體內，在多個生理過程中均發揮重要作用。APN蛋白是通過糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol, GPI)來錨定在昆蟲的中腸上皮細胞膜，在鱗翅目昆蟲中，APN被認為是Bt殺蟲蛋白相互作用的功能性膜受體。實驗表明，APN1的表達量的減少與甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)對Bt Cry1C殺蟲蛋白產生抗性相關。Tiewsiri等于2011年通過蛋白質組學等研究表明，粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中腸APN1和APN6表達量的改變與其對BtCry1Ac殺蟲蛋白的抗性相關，兩者間存在一種表達量的反式調控機制，APN6表達量的升高對于APN6表達量的降低存在一種互補機制來降低適合度代價，從而參與粉紋夜蛾對BtCry1Ac殺蟲蛋白的高抗性。