[發(fā)明專利]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除小菜蛾APN1基因及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811642687.3
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109593762A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張友軍;郭兆將;孫丹;康師;郭樂;周君雷;龔莉君;覃艦瑩;朱流紅;白楊;羅亮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90
• 代理公司: 北京知本村知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11039
• 代理人: 劉江良

1.一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的小菜蛾APN1基因的敲除方法。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，設(shè)計(jì)并合成小菜蛾APN1基因特異性sgRNA靶標(biāo)序列，將sgRNA與Cas9蛋白混合后顯微注射到小菜蛾前胚盤期卵后極部位。

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以小菜蛾四齡幼蟲新鮮蛹蛻的痕量gDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和直接測序鑒定G0代突變個(gè)體，G0代突變個(gè)體相互交配獲得G1代，直接和TA測序鑒定后選取數(shù)量足夠且具有相同突變型的雜合子個(gè)體進(jìn)行自交獲得G2代，TA測序鑒定得到能穩(wěn)定遺傳的G2代純合子個(gè)體，隨后自交獲得G3代的APN1純合基因突變型種群。

4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)在小菜蛾APN1基因編碼區(qū)的第12個(gè)外顯子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)的合成引物為：

CRISPR正向引物如SEQ ID NO. 2所示，以及CRISPR反向引物如SEQ ID NO. 3所示。

6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA終濃度為150 ng/μl，Cas9蛋白的終濃度為300 ng/μl。

7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，利用正向引物SEQ ID NO. 4和反向引物SEQID NO. 5可以特異性擴(kuò)增APN1基因sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)附近的gDNA序列。

8.一種基于CRISPR-Cas9基因敲除技術(shù)的小菜蛾APN1基因敲除試劑盒，包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示sgRNA靶標(biāo)序列和Cas9蛋白。

9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括配套的檢測試劑，用于檢測所述基因的剪切效果和評估基因敲除效率。

10.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO.3所示序列的引物；以及SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示序列的引物。