[發明專利]一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法

在審

• 申請號: 201811639613.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109487009A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 王志宏
• 申請（專利權）人: 廣州昭越生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏德昊

本發明涉及檢測試劑技術領域，且公開了一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，包括如下步驟：步驟一：提煉目的基因；步驟二：制備互補脫氧核糖核酸；步驟三：進行不對稱的PCR擴增。該能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，具備能快速定性檢測豬瘟病毒的優點。

技術領域

本發明涉及檢測試劑技術領域，具體為一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法。

背景技術

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發熱、接觸性傳染傳染病。具有高度傳染性和致死性。本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發生。

是豬的一種急性接觸性傳染病，又稱豬霍亂。1885年首先在美國發現，以后傳播到世界各大洲。中國大部分省都有發生。1903年美國獸醫學家德希尼茲和多賽特鑒定本病的病原是披蓋病毒科的瘟病毒屬中的豬瘟病毒。主要通過直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮膚均是感染途徑。一年四季都可發生，以春夏多雨季節為多，人工接種的豬，一般在36～48小時后體溫升高。而自然感染的潛伏期常為3～6天，間有延長到24天的。典型病例表現為最急性、亞急性或慢性病程，死亡率高。最急性型較少見，病豬體溫升高，常無其他癥狀，1～2天內死亡。急性型最常見，體溫可上升到41℃以上，食欲減退或消失，可發生眼結膜炎并有膿性分泌物，鼻腔也常流出膿性粘液，間有嘔吐，有時排泄物中帶血液，甚至便血。初期耳根、腹部、股內側的皮膚常有許多點狀出血或較大紅點。病程一般為1～2周，最后絕大多數死亡。亞急性型常見于本病流行地區，病程可延至2～3周；有的轉為慢性，常拖延1～2個月。表現粘膜蒼白，眼瞼有出血點。皮膚出現紫斑，病豬極度消瘦。死亡以仔豬為多，成年豬有的可以耐過。非典型病豬臨診癥狀不明顯，呈慢性，常見于“架子豬”。剖檢時急性型以出血性病變為主，常見腎皮質和膀胱粘膜中有小點出血；腸系膜淋巴結腫脹，常出現出血性腸炎，以大腸粘膜中的鈕扣狀潰瘍為典型。

傳統的豬瘟檢測方法主要包括：電泳檢測技術、熒光技術、結合試驗技術、核酸雜交、凝膠電泳等，這些方法在病毒病診斷和進出口檢驗檢疫中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如檢測時間長，實驗過程復雜，在進行大批量檢測時工作效率低，給豬瘟的檢測帶來巨大困難。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，具備能快速定性檢測豬瘟病毒的優點，解決了現在市面的檢測試劑檢測時間長，實驗過程復雜，在進行大批量檢測時工作效率低，給豬瘟的檢測帶來巨大困難的問題。

(二)技術方案

為實現能快速定性檢測豬瘟病毒的目的，本發明提供如下技術方案：一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，包括如下步驟：

步驟一：提煉目的基因

S1.準備一頭得了豬瘟的生豬，提煉生豬體內的PK-15細胞；

S2.將S1中得到的PK-15細胞放置在冷凍室內以零下70°的溫度進行凍融12-26分鐘，重復三次；

S3.提取120μlPK-15細胞和800μl的RNA裂解液放置在同一個攪拌罐內進行攪拌均勻，并且靜置8-12分鐘；

S4.在S3中拌勻的攪拌液中添加150μl的三氯甲烷，將其放入離心攪拌罐中以8500g/min的速度離心攪拌7-13分鐘；

S5.提取S4中得到液體的上層部分，并將其放置在一個干凈的試管內，并添加350μl的二甲基甲醇，靜置沉淀5-8min后再放入離心攪拌罐中以8500g/min的速率離心攪拌5min；

S6.將S5中提取的液體放置在正常室溫環境下自然晾干，再添加15μl DEPC處理過的水得到目標基因RNA；