[發明專利]一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法

在審

• 申請號: 201811639613.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109487009A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 王志宏
• 申請（專利權）人: 廣州昭越生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6806
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 顏德昊

1.一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟一：提煉目的基因

S1.準備一頭得了豬瘟的生豬，提煉生豬體內的PK-15細胞；

S2.將S1中得到的PK-15細胞放置在冷凍室內以零下70°的溫度進行凍融12-26分鐘，重復三次；

S3.提取120μlPK-15細胞和800μl的RNA裂解液放置在同一個攪拌罐內進行攪拌均勻，并且靜置8-12分鐘；

S4.在S3中拌勻的攪拌液中添加150μl的三氯甲烷，將其放入離心攪拌罐中以8500g/min的速度離心攪拌7-13分鐘；

S5.提取S4中得到液體的上層部分，并將其放置在一個干凈的試管內，并添加350μl的二甲基甲醇，靜置沉淀5-8min后再放入離心攪拌罐中以8500g/min的速率離心攪拌5min；

S6.將S5中提取的液體放置在正常室溫環境下自然晾干，再添加15μlDEPC處理過的水得到目標基因RNA；

步驟二：制備互補脫氧核糖核酸

S1.提取8μl步驟一中所得到的目標基因RNA；

S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸堿基脫氧核苷酸，在45°的溫度下養育3min，再快速冷卻2min得到互補脫氧核糖核酸；

步驟三：進行不對稱的PCR擴增

S1.提取3μl步驟二中得到的互補脫氧核糖核酸；

S2.將S1中得到的互補脫氧核糖核酸加入到80μl的不對稱PCR體系中進行充分反應，先在95°的溫度下預變性3min；92°的溫度下變性20s，53°的溫度下退火10s，70°的溫度下延伸12s，重復擴增30-60次；

S4.將S2中重復擴增的產物在70°的溫度下延伸8min；

S5.得到最終檢測試劑。

2.根據權利要求1所述的一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于：所述步驟二中的反向引物的序列是5'-GCCGATTGGTCAGGATCAAAACTTATAAAAAGCATAT-3'。

3.根據權利要求1所述的一種能快速定性檢測豬瘟病毒的檢測試劑的制備方法，其特征在于：所述步驟三中80μl不對稱PCR體系的組成為：含染料2×Taq MasterMix 10μL，滅菌去離子水(ddH2O)7.7μL，正向引物和反向引物各0.15μL，DNA模板2μL，MgCl2溶液8μl(2.5mmol/L)，三磷酸堿基脫氧核苷酸溶液2μl(10mmol/L)以及余量的無菌雙蒸水。