[發明專利]一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法

有效

• 申請號: 201811639256.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109633141B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 朱建梁;劉長偉;嚴中華
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠

本發明涉及一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，包括以下步驟：(1)細胞培養及標記；(2)堿性環境下石油醚萃取膽固醇，利用Microbeta液體閃爍計數儀進行計數，獲取待評價的抑制藥物對膽固醇代謝的抑制作用；(3)酸性環境下石油醚萃取脂肪酸，利用Microbeta液體閃爍計數儀進行計數，獲取待評價的抑制藥物對脂肪酸代謝的抑制作用。與現有技術相比，本發明建立起一套簡便，快捷，高效，高通量的膽固醇與脂肪酸提取工藝，降低了儀器設備的成本，便于操作，同時具有較高的產物提取效率，大大提高了該方法的市場競爭力。

技術領域

本發明涉及示蹤技術領域，具體涉及一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法。

背景技術

膽固醇廣泛存在于動物體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中含量也高。膽固醇是動物組織細胞所不可缺少的重要物質，它不僅參與形成細胞膜，而且是合成膽汁酸，維生素D以及甾體激素的原料。膽固醇還是臨床生化檢查的一個重要指標，在正常情況下，機體在肝臟中合成和從食物中攝取的膽固醇，將轉化為甾體激素或成為細胞膜的組分，并使血液中膽固醇的濃度保持恒定。當肝臟發生嚴重病變時，膽固醇濃度會降低。而在黃疸性梗阻和腎病綜合征患者體內，膽固醇濃度往往會升高。

脂肪酸是由碳、氫、氧三種元素組成的一類化合物，是中性脂肪、磷脂和糖脂的主要成分。當脂肪酸在人體內被氧化生成二氧化碳和水，并放出一定的熱量時，脂肪酸是一種能源。脂肪酸貯存在脂肪細胞中，以備人體不時之需。

目前，對于膽固醇以及脂肪酸生成及代謝的高通量研究方法集中在HPLC以及質譜分析。但是，該方法對于儀器設備要求較高，并不具有廣泛使用的優勢。而傳統的膽固醇和脂肪酸提取方法也局限于材料的使用量，并不具備高通量藥物篩選的條件。

膽固醇與脂肪酸代謝對于機體具有重要作用。近年來，許多疾病研究的靶點都集中在膽固醇與脂肪酸代謝途徑中的關鍵酶，即通過抑制膽固醇與脂肪酸代謝來治療相關疾病。因此，對于開發一種便于操作，對儀器設備要求較低，并且能夠進行高通量藥物篩選的膽固醇與脂肪酸合成代謝追蹤與提取方法是非常必要和緊迫的。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種對儀器設備要求低的膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，包括以下步驟：

(1)在細胞培養板上接種細胞，培養后加入待評價的抑制藥物以及C14標記的丙酮酸或乙酸，標記得到標記型細胞及培養基；此步驟中，抑制藥物進入細胞內，結合到膽固醇或脂肪酸合成的關鍵酶上，抑制其活性。

(2)將標記型細胞培養基轉移至新的聚丙烯深孔板中，加入NaOH溶液裂解細胞并將細胞裂解液轉移至上述深孔板中，再加入KOH溶液，將聚丙烯深孔板封口，并置于烘箱中加熱，然后冷卻過夜，加入無水乙醇，靜置后加入石油醚，第一次離心萃取得到上層液和下層液；此步驟中，脂肪酸與強堿發生皂化反應生成高級脂肪酸鹽溶于水相，膽固醇溶于石油醚層，便于萃取。

(3)將上層液轉移至新的聚丙烯深孔板中，真空濃縮直至石油醚全部揮發，然后加入閃爍液，混合均勻后轉移至Optiplate白色板中，利用Microbeta液體閃爍計數儀進行計數，獲取待評價的抑制藥物對膽固醇代謝的抑制作用；閃爍液將放射信號轉化成熒光分子從而進行計數。

(4)在下層液中加入濃鹽酸調節pH至小于1，然后加入石油醚進行第二次離心萃取，吸取上層石油醚至新的聚丙烯深孔板中，留下萃余層；將皂化的脂肪酸鹽重新生成不溶于水的脂肪酸，進入到石油醚層，便于萃取。

(5)在步驟(4)的萃余層中加入石油醚進行第三次離心萃取，吸取上層石油醚并和步驟(4)得到的上層石油醚合并，得到下層液萃取液；