[發明專利]一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法

有效

• 申請號: 201811639256.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109633141B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 朱建梁;劉長偉;嚴中華
• 申請（專利權）人: 輝源生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 趙志遠

1.一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）在細胞培養板上接種細胞，培養后加入待評價的抑制藥物以及C14標記的丙酮酸或乙酸，標記得到標記型細胞及培養基；加入的待評價的抑制藥物起始濃度為10~30μM，3倍稀釋，共8個點；C14標記的丙酮酸或乙酸的用量為1~3 μCi；所述標記的溫度為35~38℃，標記的時間為4~8h，標記時的氣體環境中含有4%~6% 的CO₂，接種細胞包括以下步驟：

a）在細胞培養板的孔中填充培養基，所述培養基中含有體積分數為8%~12%的胎牛血清及摩爾濃度為20~30mM的葡萄糖，每個孔中接種的細胞數為5000~10000個；

b）40~50h后更換完全新鮮的培養基；

c）15~20h后更換成新鮮的無血清及摩爾濃度為1~10mM的葡萄糖的培養基；

（2）將標記型細胞培養基轉移至新的聚丙烯深孔板中，加入NaOH溶液裂解細胞并將細胞裂解液轉移至上述深孔板中，再加入KOH溶液，將聚丙烯深孔板封口，并置于烘箱中加熱，然后冷卻過夜，加入無水乙醇，靜置后加入石油醚，第一次離心萃取得到上層液和下層液；第一次離心萃取時加入的石油醚體積與培養基體積之比為（4~6）：1，離心的轉速為800~1200rpm，離心萃取的時間為5~10min；

（3）將上層液轉移至新的聚丙烯深孔板中，真空濃縮直至石油醚全部揮發，然后加入閃爍液，混合均勻后轉移至Optiplate白色板中，利用Microbeta液體閃爍計數儀進行計數，獲取待評價的抑制藥物對膽固醇代謝的抑制作用；

（4）在下層液中加入濃鹽酸調節pH至小于1，然后加入石油醚進行第二次離心萃取，吸取上層石油醚至新的聚丙烯深孔板中，留下萃余層；第二次離心萃取時加入的石油醚體積與下層液的體積之比為（0.8~1.2）：1，離心的轉速為800~1200rpm，離心萃取的時間為5~10min；

（5）在步驟（4）的萃余層中加入石油醚進行第三次離心萃取，吸取上層石油醚并和步驟（4）得到的上層石油醚合并，得到下層液萃取液；

（6）將下層液萃取液真空濃縮直至石油醚全部揮發，然后加入閃爍液，混合均勻后轉移至optiplate白色板中，利用Microbeta液體閃爍計數儀進行計數，獲取待評價的抑制藥物對脂肪酸代謝的抑制作用。

2.根據權利要求1所述的一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，其特征在于，步驟（2）中，加入的NaOH溶液的濃度為0.1N，細胞培養板每個孔中加入的NaOH溶液體積為培養基體積的80%~120%；

加入的KOH溶液的濃度為40%~50%（W/V），細胞培養板每個孔中加入的KOH溶液體積為培養基體積的25%~40%；

所述烘箱中的溫度為70~90℃，加熱時間為0.5~2h；

加入的無水乙醇的體積與培養基體積之比為（1.5~3）：1：靜置的時間為0.5~2h。

3.根據權利要求1所述的一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，其特征在于，所述真空濃縮的溫度為40~60℃，所述閃爍液體積為150μl~250μl。

4.根據權利要求1所述的一種膽固醇以及脂肪酸代謝抑制藥物的高通量評價方法，其特征在于，第三次離心萃取時加入的石油醚體積與萃余層的體積之比為（0.4~1）：1，離心的轉速為800~1200rpm，離心萃取的時間為5~10min。