[發明專利]快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條及其制備與應用

在審

• 申請號: 201811639111.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109633171A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 胡小龍;周麗;朱凱
• 申請（專利權）人: 上海八通生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533;G01N33/543
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條，包括底板，沿底板長度依次設置的樣品墊、結合物釋放墊、層析膜及吸水墊，所述的層析膜上設有檢測線與質控線，所述的檢測線與質控線相互分離，其特征在于，所述的結合物釋放墊上固定有熒光微球標記GFAP單克隆抗體的熒光探針，所述檢測線處包被有與微球標記抗體配對的GFAP抗原，所述的質控線處包被有羊抗鼠IgG抗體。

2.根據權利要求1所述的一種快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條，其特征在于，所述結合物釋放墊為玻璃纖維材質，所述層析膜采用硝酸纖維素膜，所述樣品墊上設有加樣孔。

3.如權利要求1所述快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備熒光微球標記GFAP單克隆抗體的熒光探針；

(2)用浸泡結合物釋放墊的方式將制備的熒光探針固定在結合物釋放墊上，冷凍干燥后，密封保存備用；

(3)包被GFAP抗原及羊抗鼠IgG抗體劃線于層析膜上，分別為檢測線和質控線；

(4)將樣品墊、結合物釋放墊、層析膜與吸水墊粘帖在底板上，組成快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條。

4.根據權利要求3所述快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述GFAP抗原的制備方法為：

1.1、表達質粒的構建：

1.1.1雙酶切：確定GFAP基因兩側的內切酶；

1.1.2連接：將目的片段與載體片段連接后轉染目的菌株；

1.1.3轉菌：轉菌涂平板，通過菌落PCR鑒定片段的存在；

1.1.4菌種保存：挑取陽性菌落在合適的抗性LB培養基培養并用滅菌甘油保存；

1.2、重組蛋白的表達和純化：

1.2.1培養：挑取含有GFAP表達質粒，接種入LB培養基中，震蕩培養；

1.2.2誘導表達：用IPTG誘導，E.coli表達GFAP并收集菌體；

1.2.3蛋白純化：菌體破碎后過鎳柱，用咪唑洗脫純化蛋白；

1.3、重組蛋白的鑒定：

1.3.1純化蛋白采用SDS-PAGE的方法鑒定純度；

1.3.2采用GFAP試劑盒鑒定目的蛋白是否正確收集。

5.根據權利要求3所述快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述GFAP單克隆抗體的制備方法為：

2.1、動物免疫：GFAP蛋白對Balb/C小鼠進行免疫；

2.2細胞融合：利用免疫小鼠的脾細胞和SP2/0細胞進行融合，得到雜交瘤細胞；

2.3細胞篩選：利用有限稀釋法結合間接ELISA方法來篩選得到陽性單克隆雜交瘤細胞；

2.4抗體制備：利用小鼠腹水來體外擴增富集單克隆抗體；

2.5抗體純化：利用辛酸-硫酸銨法和親和層析法對腹水進行純化，透析后測定A280確定蛋白濃度待用。

6.根據權利要求3所述快速檢測GFAP的熒光免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于，所述熒光微球標記GFAP單克隆抗體的熒光探針中，所述熒光微球是時間分辨熒光微球；

所述熒光微球標記GFAP單克隆抗體的熒光探針的方法為：

(1)、用NHS及EDC溶液活化微球；

(2)、充分混勻后，靜置；

(3)、將GFAP單克隆抗體加入到活化好的微球中，使微球的終濃度為0.5mg/ml，先靜置偶聯，再靜置過夜；

(4)、在偶聯好的微球中加入封閉液和10％Tween-20，混勻，靜置；

(5)、離心清洗微球；

(6)、吸去上清后，加入微球保存液，分散均勻，即為熒光微球標記GFAP單克隆抗體的熒光探針。