[發明專利]一種檢測BCR-ABL融合基因ABL激酶區突變的方法

在審

• 申請號: 201811636832.7
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109777864A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 尤雋丹;郝瑋;李小青
• 申請（專利權）人: 武漢康圣達醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供了一種檢測BCR?ABL融合基因ABL激酶區突變的方法。該方法采用COLD?PCR結合二代測序的方法檢測外周血或骨髓中BCR?ABL融合基因兩種剪切型M?bcr和m?bcr中的ABL激酶區耐藥突變，即在同一體系內先擴增M?bcr和m?bcr的BCR?ABL融合基因，再進行COLD?PCR擴增ABL激酶區，并利用CLOD?PCR的原理封閉野生型模板，利用Tc溫度富集少量突變基因，同時通過二代測序的方法提高檢測靈敏度。本發明方法具有操作簡單、重復性好、高通量檢測標本、報告時間短等特點，尤其適用于少量突變克隆株的檢測。使用該方法將顯著提高突變檢測的敏感度及復合突變的檢測能力。

技術領域

本發明涉及基因組測序技術領域，具體地說，涉及一種檢測BCR-ABL融合基因ABL激酶區突變的方法及試劑盒。

背景技術

慢性髓細胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種造血干細胞克隆增生性疾病，骨髓以髓系增生，外周血白細胞增多及脾臟腫大為主要特征。對CML而言，突變克隆的擴增可能是一個漸進的過程，開始階段突變克隆比例較低，但一旦出現會很快增高并導致疾病惡化。耐藥性的突變往往出現于CML急變期前或伴隨急變期出現，因此定期監測突變情況是必要的，可以及早發現突變并相應調整治療方案。對于某些預后不良的突變來說，在低水平時就較早地檢測出來是非常有意義的。CML患者的BCR-ABL融合基因M-bcr剪切型的ABL激酶區耐藥突變檢測結果和Ph+(費城染色體)陽性的ALL(急性淋巴細胞白血病)患者m-bcr剪切型的ABL激酶區耐藥突變的檢測結果，為臨床醫生用藥提供參考，如果能夠在低水平突變時檢測到突變，臨床醫師可以盡早調整治療方案。

目前對ABL激酶區突變的檢測主要是Sanger測序法和HRM法。Sanger測序法是從外周血或骨髓中提取RNA，采用隨機引物逆轉錄cDNA，以此為模板做半巢式PCR分別擴增M-bcr和m-bcr兩種剪切體的BCR-ABL融合基因，得到擴增產物后以其為模板，擴增ABL激酶區，得到的產物，用一代測序的方法檢測其中ABL激酶區片段的突變。該方法只能檢測突變頻率高于10％-20％的突變，低于此頻率的突變則會被漏檢。

HRM法是在一定的溫度范圍內將BCR-ABL融合基因中ABL基因PCR擴增的產物進行變性，期間實時檢測體系內熒光信號。熒光值隨著溫度變化，可繪制溶解曲線。每一段DNA都有其獨特的序列，因而也就有了獨特的熔解曲線形狀，如同DNA指紋圖譜一樣，具有很高的特異性、穩定性和重復性。根據曲線準確區分野生型和突變型基因。上述Sanger測序法靈敏度低，HRM法只能檢測樣本中特定突變位點，如果要檢測多個位點則成本較高，同時由于檢測通量的局限性，不能批量檢測而難以滿足實際應用的需要。

二代測序技術已廣泛應用于基礎研究與臨床基因檢測，采用COLD-PCR結合二代測序的方法有望檢測外周血或骨髓中BCR-ABL融合基因ABL激酶區突變，尤其適用于少量突變克隆株的檢測。

發明內容

本發明的目的是提供一種高靈敏度檢測BCR-ABL融合基因ABL激酶區突變的方法及試劑盒。

本發明提供了一種檢測BCR-ABL融合基因ABL激酶區突變的方法，包括步驟：從外周血或骨髓樣本中提取RNA，隨機引物逆轉錄成cDNA，再以cDNA為模板，在同一反應體系中擴增待測樣品中BCR-ABL融合基因兩種剪切型M-bcr和m-bcr，以擴增產物為模板，COLD-PCR擴增ABL激酶區，構建文庫，文庫混合制備模板后上機測序。

本發明的方法中，所述在同一反應體系中擴增待測樣品中BCR-ABL融合基因兩種剪切型M-bcr和m-bcr的方法為：以待測樣品RNA逆轉錄而成的cDNA為模板，以SEQ ID NO.1-3所示序列為引物，進行PCR擴增。

SEQ ID NO.1、2、3所示序列的引物在PCR反應體系中初始物質的量比例為1:1:2。