[發明專利]一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法

在審

• 申請號: 201811636671.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109468415A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 楊苗;林華;李建臻;陳世界;方智;張婧;安微;張妙;薛昌華
• 申請（專利權）人: 四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 成都弘毅天承知識產權代理有限公司 51230
• 代理人: 白小明

本發明公開了一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，包括以下步驟：(1)設計特異性引物與探針；(2)優化熒光定量PCR反應體系和反應條件；(3)提取含有目的序列的質粒標準品，作為熒光定量PCR陽性模板，進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線和標準曲線；(4)提取待測樣品的病毒RNA，進行熒光定量PCR擴增，檢測所提取病毒是否為傳染性肌肉壞死病毒陽性。本發明以全基因組的5’?3’的第835個堿基至第901個堿基為目的序列，設計特異性引物和探針，檢測靈敏度高、特異性強，且檢測結果的重復性高，準確可靠，對操作人員技術要求低，易于實現標準化，尤其適用于出入境對蝦的檢疫。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法。

背景技術

水產養殖是指在人為控制的條件下繁養、培育并且收獲水生動植物的生產活動。病毒性疾病是水產養殖中影響產量的重要因素，密集和多樣的養殖方式使得許多病毒有了可乘之機，傳染性肌肉壞死病毒(IMNV)就是其中之一，南美白對蝦是已知IMNV的最易感蝦種，在生長的各個階段均可被感染。該病第一次于2002年出現于巴西的凡納濱對蝦養殖廠，2006年傳入印度尼西亞，感染蝦出現體色發白、腹節發紅、尾部肌肉組織呈點狀或擴散狀，體表有不規則黑斑的癥狀，死亡率在40％～70％不等。

IMNV為雙鏈RNA病毒，主要侵染南美白對蝦的橫紋肌組織，檢測手段是發現感染性疾病的方法之一，針對該病毒核酸序列的研究使建立靈敏、特異的檢測方法、發展有效的治療措施成為可能。IMNV病毒核酸為雙鏈不分節段的RNA，不同株的總核苷酸數有些許差別，但大約為8226-8230bp，具有兩個不重疊的開放閱讀框(ORF)，ORF1編碼RNA結合蛋白、主要衣殼蛋白，ORF2編碼RNA依賴的RNA聚合酶，是相對保守的區域。截止到目前為止，GenBank中共有該病毒的序列共有18個結果，其中NC-007915與AY570982相同，全基因組序列7個，10個IMNV的部分基因序列。

IMNV的檢測方法包括免疫學檢測方法和以核酸為基礎的檢測方法，免疫學檢測方法的原理是利用特異的抗原抗體反應來檢測病毒的方法，不同于病毒的分離培養，免疫學的方法用時短，不需要特定的實驗室條件，可以發展為商品化的試劑盒，方便快捷，適合于塘邊檢測。以核酸為基礎的檢測方法由于高靈敏度和高特異性的特點，已經廣泛用于實驗室檢測。目前我國尚未報道IMNV感染對蝦的案例，但隨著經濟全球化進程的不斷深入，跨境交流越來越頻繁，外來疫病的傳入的風險也隨之擴大，控制風險的主要方式是加強入境動物的檢疫，準確、靈敏、重復性好，且易于標準化的檢測方法是出入境對蝦檢疫所迫切需要的。現有IMNV的熒光定量PCR檢測方法將研究重點放在靈敏度和特異性上，而忽略了重復性，重復性差導致無法獲得準確的檢測結果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，該檢測方法設計特異性引物和探針，檢測靈敏度高、特異性強，且檢測結果的可重復性高，對操作人員技術要求低，易于實現標準化。

本發明采用的技術方案如下：

一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，包括以下步驟：

(1)引物設計：查找GenBank中的傳染性肌肉壞死病毒的全基因序列，以全基因組的5’-3’的第835個堿基至第901個堿基為目的序列，使用Primr premier軟件設計特異性引物與TaqMan探針，序列如下，方向5’→3’：

正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；

反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；

探針：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam標記，3’端用BHQ-1標記；

(2)優化熒光定量PCR反應體系和反應條件；