[發明專利]一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法在審
| 申請號： | 201811636671.1 | 申請日： | 2018-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN109468415A | 公開（公告）日： | 2019-03-15 |
| 發明（設計）人： | 楊苗;林華;李建臻;陳世界;方智;張婧;安微;張妙;薛昌華 | 申請（專利權）人： | 四川出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93 |
| 代理公司： | 成都弘毅天承知識產權代理有限公司 51230 | 代理人： | 白小明 |
| 地址： | 610041 四川*** | 國省代碼： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 傳染性肌肉壞死病毒 熒光定量PCR 特異性引物 堿基 擴增 探針 檢測 熒光定量PCR反應 檢測靈敏度 質粒標準品 標準曲線 待測樣品 反應條件 檢測結果 擴增曲線 全基因組 人員技術 特異性強 陽性模板 病毒RNA 對蝦 標準化 病毒 檢疫 優化 | ||
1.一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)引物設計：查找GenBank中的傳染性肌肉壞死病毒的全基因序列，以全基因組的5’-3’的第835個堿基至第901個堿基為目的序列，使用Primr premier軟件設計特異性引物與TaqMan探針，序列如下，方向5’→3’：
正向引物：GAAGCCTAAATACACATCGAC；
反向引物：CTGCTTCGCTAAAACCTG；
探針：AAAACCGGAGCTGACCAC，5’端用Fam標記，3’端用BHQ-1標記；
(2)優化熒光定量PCR反應體系和反應條件；
(3)提取含有目的序列的質粒標準品，作為熒光定量PCR陽性模板，進行質粒濃度檢測，計算出重組質粒的拷貝數，以10倍稀釋度將質粒進行倍比稀釋，將其作為標準質粒模板，并設立無模板對照，進行熒光定量PCR擴增，獲得擴增曲線和標準曲線；
(4)提取待測樣品的病毒RNA，進行熒光定量PCR擴增，檢測所提取病毒是否為傳染性肌肉壞死病毒陽性。
2.根據權利要求1所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，熒光定量PCR反應體系為：反應總體積25μL，其中Probe qPCRSuperMix 12.5μL、RNase Free Water 7.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探針1μL、模板2μL。
3.根據權利要求2所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的條件為：94℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火延伸1min，40個循環。
4.根據權利要求1所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(4)中，熒光定量PCR反應體系為：反應總體積為25μL，其中2*OneStep RT-PCR Buffer III12.5μL、TaKaRaEx Taq HS 0.5μL、PrimeScript RT Enzyme MIXII 0.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL、探針0.7μL、ddH20 6.8μL，模板2μL。
5.根據權利要求4所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的條件為：42℃預變性5min，95℃變性10s，95℃退火10s，60℃延伸1min，40個循環。
6.根據權利要求1所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，將質粒標準品稀釋成108-101拷貝/μL的8個濃度梯度作為標準質粒模板。
7.根據權利要求1所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，采用ddH2O作為無模板對照。
8.根據權利要求1所述的一種傳染性肌肉壞死病毒的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，含有目的序列的質粒標準品為：使用步驟(1)中的特異性引物擴增出目的序列，將目的序列連入pUC57-simple載體，然后轉化到大腸桿菌中進行擴繁，從大腸桿菌中提取所需含有目的序列的質粒標準品。
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