[發明專利]一種真皮成纖維細胞皮片及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201811635902.7
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109771697B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 方攀峰;陳爽;王志剛
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

本發明提出了一種自體真皮成纖維細胞皮片的構建方法，所述方法為：將體外擴增的真皮成纖維細胞接種到經過脫細胞、脫脂、脫核酸處理的羊膜組織進行細胞固化，構建真皮成纖維細胞?羊膜組織的復合結構，在細胞培養條件下富集高純度細胞，獲得所述自體真皮成纖維細胞皮片。本發明還提出了由該方法構建得到的自體真皮成纖維細胞皮片。本發明自體真皮成纖維細胞皮片可用于燒傷創傷、大面積植皮、及其他急需大面積皮膚缺損的臨床需求，具有低排異、可持續供應等優點，有廣泛應用前景。

技術領域

本發明涉及真皮成纖維細胞體外生產技術領域，具體涉及一種真皮成纖維細胞皮片及其構建方法和應用。

背景技術

自體真皮成纖維細胞體外生產技術：自體細胞的體外生產技術目前已經十分成熟。成人自體真皮的成纖維細胞體外增殖技術，已經達到了產業化要求，在國外已經有該產品注射劑上市，國內也出現類似產品。現在成人真皮成纖維細胞的規模化生產朝向高效、高純度、高活性的方向發展；產品用途可直接制備注射劑，也可以作為其他制劑的主要原料成分。

脫上皮層羊膜構建固體細胞技術：細胞固化技術發展至今，逐漸分成兩類，一類是利用生物組織膜進行脫細胞-加細胞處理，另一類是利用生物凝膠材料融合細胞制成立體凝膠片。其中生物組織膜+細胞的產品中，已經在人工皮膚、人工角膜、其他人工組織膜中進行臨床研究。人脫細胞羊膜作為組織工程支架具有容易獲得、良好的生物相容性、可降解性及低免疫原性等優點，已經用于組織工程皮膚、組織工程角膜的制作。但其也存在一些不足，包括強度欠佳、植入后可能存在排異反應等。目前，國內治療皮膚燒傷創傷的上市組織工程皮膚產品中，只有異體細胞“安體膚”，自體細胞“PELNAC”。

發明內容

為克服現有技術存在的上述技術問題，本發明創新提出了一種真皮成纖維細胞皮片的構建方法、以及由該方法構建得到的真皮成纖維細胞皮片。

本發明提出的一種真皮成纖維細胞皮片的構建方法，將體外擴增的真皮成纖維細胞接種到經過脫脂、脫細胞、脫核酸處理的羊膜組織進行細胞固化，構建真皮成纖維細胞-羊膜組織的復合結構；然后在擴增培養基中培養，在細胞培養條件下富集高純度細胞，獲得所述真皮成纖維細胞皮片。本發明中，成人體細胞的體外規模化生產為皮片提供足量、高純度的活細胞，即原料生產；原料細胞固定化在去活性的固化結構上，即產品生產。

其中，所述真皮成纖維細胞為成人真皮成纖維細胞(HDFB)，優選地，為FI表型成人真皮成纖維細胞。按形態和代謝規律，成人真皮成纖維細胞可以分為七個Bayreuther表型，其中，FI表型、FII表型，在原代培養的初期最為常見。FI表型細胞為長梭形排列生長，增殖速度更快，是構成真皮組織層最厚實部位的主要細胞類型，在體外培養的形態為長梭形，約12小時增殖一倍，且分泌I型膠原蛋白，以促進自身和皮膚組織其他細胞的增殖。FII表型細胞為上皮性，緊密生長，速度較慢。

本發明中，獲得高純度成人真皮成纖維細胞。為了獲得高純度的FI表型成纖維細胞，本發明提出必須在原代培養的初期進行提純，即，本發明中，在原代培養的第三至五天，采用顯微操作直接剔除的方法，按細胞形態，去除其他表型細胞。本發明中，在原代培養初期通過顯微操作、直接剔除的方法得到提純的真皮成纖維細胞，此后的原代培養和傳代中，可以獲得高純度的FI表型細胞。相比較地，傳統方法是在獲得細胞后進行染色分析，區別表型，再用分步消化方法，分離不同細胞，該傳統方法不能完全剔除雜細胞，耗時約需7天左右。

本發明中，生產得到高產量成人真皮成纖維細胞。本發明中，在原代培養初期，提高FBS的濃度，利用高血清環境，促進原代組織中細胞的進入培養容器貼壁生長，縮短原代培養的時間，得到高產量成人真皮成纖維細胞。原代培養初期是指細胞開始體外繁殖的前8代。