[發明專利]一種真皮成纖維細胞皮片及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201811635902.7
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109771697B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 方攀峰;陳爽;王志剛
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/60;C12N5/071
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種真皮成纖維細胞皮片的構建方法，其特征在于，所述方法為：

步驟（1）：將體外擴增的真皮成纖維細胞結合到經過脫細胞、脫脂、脫蛋白、脫核酸處理的羊膜組織進行細胞固化，構建真皮成纖維細胞-羊膜組織的復合結構；所述真皮成纖維細胞為FI表型成人真皮成纖維細胞；

所述真皮成纖維細胞的原代組織在原代培養基中進行培養，所述原代培養基含有以下體積百分比的組分：70%－86%DMEM高糖培養基、12%－18%胎牛血清、0.5%－1%非必需氨基酸、0.5%－1%谷氨酰胺、和1%－10%青鏈霉素；

其中，所述真皮成纖維細胞原代培養的條件為，在37℃，二氧化碳濃度5%的條件下進行培養；

所述真皮成纖維細胞在原代培養初期通過顯微操作、直接剔除的方法進行提純；

所述脫細胞處理液包括 Triton X-100，體積分數0.1%-0.5%；

所述脫脂處理液包括生理鹽水、中性脂肪酶，pH為7.0至7.4，中性脂肪酶濃度為5-10U/mL；

所述脫蛋白處理液包括生理鹽水、堿性胰蛋白酶；

所述脫核酸處理液包括核酸酶、SDS，溶液pH為7.0至7.4，質量濃度為0.3-0.8 %；所述脫細胞、脫脂、脫蛋白、脫核酸的處理過程，均為37℃，動態處理，羊膜被固定住；

其中，所述非必需氨基酸為賴氨酸；

所述的FI表型成人真皮成纖維細胞的單細胞懸液進行流式細胞儀檢驗，檢驗抗體為CD73、CD90、CD105，陽性率均在95%以上；

步驟（2）：在擴增培養基中培養，獲得所述真皮成纖維細胞皮片；

所述擴增培養基含有以下體積百分比的組分：84%－92%DMEM高糖培養基、7%－15%胎牛血清(FBS)、0.5%－1%非必需氨基酸、0.5%－1%谷氨酰胺；

所述真皮成纖維細胞皮片是由真皮成纖維細胞-羊膜組織的復合結構進行半濕性培養獲得的，具體步驟如下：

構建真皮成纖維細胞-羊膜組織的復合結構

在無菌條件下，將羊膜片平鋪在培養容器中；將真皮成纖維單細胞溶于細胞擴增培養基中，并加入I型膠原蛋白，制成真皮成纖維單細胞懸液，結合到羊膜片上，進行細胞固化，得到在羊膜片上形成真皮成纖維細胞-膠原蛋白凝膠的真皮成纖維細胞-羊膜組織的復合結構；

半濕性培養

上述復合結構組織平鋪在培養容器中，羊膜朝下，真皮成纖維細胞-膠原蛋白凝膠朝上；接入擴增培養基，液面沒過凝膠層，培養3天后，得到真皮成纖維細胞皮片。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，真皮成纖維細胞的原代組織在原代培養基中進行培養；然后進行所述體外擴增，所述體外擴增的方法為消化-重懸-稀釋接種；其中，所述消化的條件為：在胰蛋白酶-EDTA的作用下，37℃，消化2～3分鐘；所述重懸的條件為：在含血清溶液中，37℃、機械吹打；所述稀釋接種是指，在擴增培養基中，每1 cm²培養面積接種10⁴個細胞，進行傳代培養。

3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述真皮成纖維細胞結合到羊膜組織進行細胞固化的方法為接種培養；所述接種培養的構建原料包括真皮成纖維細胞、膠原蛋白、細胞擴增培養基或生理鹽水。

4.一種按權利要求1所述的構建方法制備得到的真皮成纖維細胞皮片。

5.如權利要求4所述的真皮成纖維細胞皮片在制備治療燒傷創傷、慢性疾病或皮膚缺損、慢創燒傷的產品中的應用，或在制備用于植皮的產品中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述真皮成纖維細胞皮片用于預防、消除和/或減少皺紋。