[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811635230.X
• 申請(qǐng)日: 2018-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN109652459B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡小芬;曾志將;王子龍;顏偉玉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/90
• 分類號(hào): C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京集智東方知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩;龔建蓉

本發(fā)明公開了一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法及基因編輯材料，其包括如下步驟：S1、確定靶基因的sgRNA序列；S2、合成靶基因的sgRNA；S3、在蜂卵的尾部背側(cè)或近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料，以及進(jìn)行注射卵的后期孵化；S4、注射卵靶基因的PCR擴(kuò)增；以及S5、對(duì)步驟S4中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以獲得靶基因的基因編輯結(jié)果。其將蜜蜂基因編輯中的注射位點(diǎn)由尾部改為靠近頭端的腹側(cè)；同時(shí)首次在蜜蜂中使用sgRNA+Cas9蛋白混合物為基因編輯材料，高效地獲得了G0代雙敲Indel突變體，大大簡(jiǎn)化了培育雙敲突變體工蜂的繁育過程，降低了蜜蜂基因編輯研究的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法及編輯材料。

背景技術(shù)

蜜蜂是一種在授粉中發(fā)揮著重要作用的飛行昆蟲，也是在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中起著支撐作用的關(guān)鍵物種。

目前有關(guān)蜜蜂基因編輯成功的報(bào)導(dǎo)都是通過注射基因編輯原料(例如mRNA)到蜂卵的尾部來產(chǎn)生有基因編輯的性細(xì)胞，從而產(chǎn)生突變的后代來達(dá)到產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因蜜蜂的目的。但由于當(dāng)卵裂細(xì)胞到達(dá)尾部時(shí)，胚胎本身的卵裂細(xì)胞總量已經(jīng)是非常大了，因此產(chǎn)生基因編輯的細(xì)胞數(shù)量比較多，一個(gè)個(gè)體的后代就會(huì)有多種編輯體的出現(xiàn)，由此，對(duì)于篩選到單一的編輯體是比較困難的。而且，這種方式獲得突變體后代的效率也非常低。

其次，為了獲得目標(biāo)基因雙等位突變的工蜂，需要幾代蜂的繁育過程，而該過程要求的技術(shù)難度相對(duì)比較高，經(jīng)歷的時(shí)間較為漫長(zhǎng)。同時(shí)，期間會(huì)增加嵌合體蜂王逃逸的可能性，由此可能進(jìn)一步引發(fā)因嵌合體蜜蜂逃逸而對(duì)生態(tài)環(huán)境帶來的破壞。

因此，迫切需要?jiǎng)?chuàng)建一種高效的蜜蜂基因編輯技術(shù)。該技術(shù)可以在基因編輯處理后的當(dāng)代(G0)個(gè)體就能產(chǎn)生雙等位基因敲除的突變體，即完全突變體。這些完全突變的工蜂可以直接用于蜜蜂基因功能的研究等其他相關(guān)各種科學(xué)研究的需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有基因編輯技術(shù)的上述缺陷，提供了一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法及編輯材料，其將蜜蜂基因編輯中的胚胎注射位點(diǎn)由性細(xì)胞存在的尾部改為合子形成的近頭端腹側(cè)，由此將編輯目標(biāo)由性細(xì)胞轉(zhuǎn)變成合子；同時(shí)首次使用sgRNA+Cas9蛋白混合物作為編輯材料，高效地獲得了G0代雙敲Indel突變體，大大簡(jiǎn)化了培育雙敲突變體工蜂的繁育過程，降低了蜜蜂基因編輯研究的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一方面，提供了一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法，其包括如下步驟：

S1、確定靶基因的sgRNA序列；

S2、合成靶基因的sgRNA；

S3、在蜂卵的近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料，以及進(jìn)行注射卵的后期孵化；

S4、注射卵靶基因的PCR擴(kuò)增；

以及S5、對(duì)步驟S4中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以獲得靶基因的基因編輯結(jié)果。

優(yōu)選的，所述靶基因?yàn)槊鄯銶rjp1基因或Pax6基因。

優(yōu)選的，步驟S3中，所述編輯材料為靶基因的sgRNA與Cas 9蛋白的混合物；當(dāng)在蜂卵的尾部背側(cè)顯微注射編輯材料時(shí)，每ml編輯材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白；當(dāng)在蜂卵的近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料時(shí)，每ml編輯材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。

優(yōu)選的，步驟S3中，當(dāng)在蜂卵的尾部背側(cè)顯微注射編輯材料時(shí)，每ml編輯材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白；當(dāng)在蜂卵的近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料時(shí)，每ml編輯材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。