[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811635230.X
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109652459B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡小芬;曾志將;王子龍;顏偉玉
• 申請（專利權(quán)）人: 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京集智東方知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11578
• 代理人: 吳倩;龔建蓉

1.一種基于CRISPR/Cas9的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、確定靶基因的sgRNA序列；

S2、合成靶基因的sgRNA；

S3、在蜂卵的近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料，以及進(jìn)行注射卵的后期孵化；

S4、注射卵靶基因的PCR擴(kuò)增；

以及S5、對步驟S4中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，以獲得靶基因的基因編輯結(jié)果。

2.如權(quán)利要求1所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，所述靶基因?yàn)槊鄯銶rjp1基因或Pax6基因。

3.如權(quán)利要求1所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，步驟S3中，所述編輯材料為靶基因的sgRNA與Cas 9蛋白的混合物，每ml編輯材料中含有180-220ng靶基因sgRNA以及180-220ng Cas 9蛋白。

4.如權(quán)利要求3所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，每ml編輯材料中含有200ng靶基因sgRNA以及200ng Cas 9蛋白。

5.如權(quán)利要求1所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，步驟S3包括：

S31、在蜜蜂的繁殖季節(jié)，將用于采集待注射卵的人工巢脾進(jìn)行無卵化處理；將無卵化處理后的人工巢脾放置到蜂箱中，以讓工蜂進(jìn)行清理過夜，同時將蜂王與人工巢脾進(jìn)行隔離；

S32、將蜂王關(guān)在人工巢脾的固定范圍內(nèi)排卵，且關(guān)王排卵時間為2-2.5小時，產(chǎn)卵后放出蜂王；

S33、顯微鏡下采用注射針在蜂卵的近頭端腹側(cè)完成編輯材料的注射，以獲得注射卵，且每個卵在45-60s內(nèi)完成注射全過程，且保證完成編輯材料注射后的卵處在1細(xì)胞期。

6.如權(quán)利要求5所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，步驟S33中，所述注射針為內(nèi)徑2-5μm、尖端帶有刃的玻璃針。

7.如權(quán)利要求5所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，步驟S33中，當(dāng)在蜂卵的近頭端腹側(cè)顯微注射編輯材料時，所述注射針與卵的近頭端腹側(cè)的夾角小于30度，沿頭側(cè)向尾側(cè)的方向進(jìn)針，注射壓600hPa，平衡壓50hPa，且所述注射針進(jìn)入卵內(nèi)后，將編輯材料注入卵內(nèi)的時間為0.1s。

8.如權(quán)利要求1所述的蜜蜂基因編輯方法，其特征在于，所述步驟S5中還包括：選取與注射卵相同孵化日齡的蜂卵，進(jìn)行相同的靶基因的PCR擴(kuò)增，并將該P(yáng)CR產(chǎn)物測序后的結(jié)果作為注射卵靶基因編輯結(jié)果的空白對照。