[發明專利]靶向抑制miR-34a的人工環狀RNA的通用表達框架、表達方法及其應用

在審

• 申請號: 201811634414.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109554368A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 張騰;羅衛峰;岳穎;趙玉曉;余衛國
• 申請（專利權）人: 上海銳賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;A61K48/00;A61K31/7088;A61P3/04;A61P3/06;A61P3/10;A61P1/16
• 代理公司: 上海三方專利事務所 31127
• 代理人: 吳瑋;楊懿

本發明涉及靶向抑制miR?34a的人工環狀RNA的通用表達框架、表達方法及其應用，該通用表達框架由上游序列、中間序列以及下游序列三部分組成。按本發明所述的靶向抑制miR?34a的人工環狀RNA通用表達框架可由質粒或病毒工具介導在細胞內表達靶向抑制miR?34a的人工環狀RNA分子，具備在胞內實現抑制miR?34a?5p生物功能的能力。本發明還涉及該通用表達框架及攜帶此表達框架的真核表達質粒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒在制備肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病的藥物中的應用。

[技術領域]

本發明涉及靶向抑制miR-34a的人工環狀RNA的通用表達框架、表達方法及其在制備肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病的藥物中的應用。

[背景技術]

近年隨著人們生活水平的提高，能量攝入過剩相關的肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病等諸多代謝異常疾病的患病率日益升高。據2018中國國民健康與營養大數據報告顯示，超重或肥胖的國民或超過2億，其中血脂異常(含高脂血癥)患者1.6億、脂肪肝患者1.2億、糖尿病患者超過9000萬，糖脂代謝異常疾病嚴重影響人們的健康，因此，開發有效調節糖脂代謝，維持糖脂代謝穩態的藥物對于肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病的治療具有重要價值。

肝臟在能量代謝過程中發揮重要作用，肝臟糖代謝和脂代謝功能的紊亂與包括肥胖、脂肪性肝病、高脂血癥以及糖尿病等代謝類疾病的發生息息相關。CRTC2是維持肝臟糖脂代謝穩態的一個重要調節因子。研究證實，在長期能量攝入過剩的條件下，肝臟Crtc2高表達并激活Creb轉錄活性。Crtc2/Creb復合體啟動miR-34a的轉錄，肝臟細胞高表達miR-34a抑制Sirt1/Pparα信號通路。做為肝臟甘油三酯代謝的重要調控通路，Sirt1/Pparα信號通路的抑制會導致脂代謝異常，肝臟和血液甘油三酯的含量上升。同時Sirt1/Pparα信號通路的抑制會降低FGF21的分泌，致使肝臟能量代謝失衡，胰島素敏感性降低，胰島負荷增加。因此，長期能量攝入過剩條件下，miR-34a過量表達誘導的sirt1/Pparα信號通路的長期抑制是肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病等代謝疾病的重要誘因。研究人員在高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型中證實，miR-34a的表達抑制是解除長期能量攝入過剩條件下肝臟病變和能量代謝失調的關鍵。因此，miR-34a作為靶點，在肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病的藥物開發中極具價值。

目前，以microRNA作為靶點的藥物開發主要集中在體外合成microRNA的模擬物或拮抗分子，在體內模擬或抑制microRNA的生物活性，以期進行疾病的治療。例如EnGenelC開發的MesomiR-1(miR-16mimic)和Mirna Therapeutics開發的MRX34(miR-34mimic)兩種核酸小分子藥物，均為microRNA的模擬物。然而，限于核酸藥物本身的理化性質，microRNA的模擬物或拮抗物藥物開發存在諸多障礙，其中最主要的就是藥物分子在體內靶向遞送和半衰期。雖然目前核酸分子的化學修飾技術以及核酸藥物的遞送技術有了很大的提高，但是microRNA的模擬物或拮抗分子藥物開發仍需更有效的解決遞送效率和體內穩定性的問題。

[發明內容]

本發明的目的在于提供一種具備高效靶向抑制miR-34a的人工環狀RNA及其通用表達框架，以及攜帶該人工環狀RNA分子通用表達框架的真核表達質粒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒在制備肥胖、脂肪肝、高脂血癥和糖尿病的藥物中的應用。

為實現上述目的，本發明包括一種式I序列的人工環狀RNA的通用表達框架，

其中，

US為上游序列，堿基序列如SEQ ID NO.1所示，

DS為下游序列，堿基序列如SEQ ID NO.2所示，

34inh為miR-34a-5p的吸附抑制位點的序列，堿基序列如SEQ ID NO.3所示，