[發(fā)明專利]一種檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器及其制備方法

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• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109406477A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設計）人: 黃加棟;趙一菡;劉素;王玉;瞿曉南;張儒峰;李莎莎;王業(yè)茹;孫文玉;張曼茹;江龍;趙崇政
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發(fā)明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于催化發(fā)夾自組裝檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器，基于甲基化后的目標物與核酸探針特異性識別，利用催化發(fā)夾自組裝不斷形成三通路結構，同時循環(huán)放大Trigger，在三通路的末端，通過堿基互補配對結合含有熒光基團的Signal probe，最后利用了核酸內(nèi)切酶IV的切割位點（AP位點），實現(xiàn)定位切割，釋放熒光基團產(chǎn)生一定強度的熒光信號的生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優(yōu)點，彌補了現(xiàn)有對DNA甲基化檢測的不足，實現(xiàn)對甲基化的快速，準確的定量檢測。

技術領域

本發(fā)明涉及生物傳感器技術領域，特別涉及基于催化發(fā)夾自組裝檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器，還涉及其制備方法。

背景技術

DNA甲基化在細胞增殖中起重要作用，衰老和基因轉錄。兩種過度甲基化（超甲基化）和缺乏甲基化（低甲基化）已經(jīng)在多種類型的癌癥中被鑒定出來，例如乳腺癌，卵巢癌，和肺癌。在許多人中病例，異常的DNA甲基化模式已經(jīng)存在與異常的DNA MTase活性相關，因此，DNA甲基化被公認為新一代癌癥生物標志物和新的抗腫瘤治療的藥理學靶點。

目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于DNA MTase的方法測定，如放射性測定，高效液體色譜（HPLC）、種免疫化學方法和凝膠電泳。但是，大多數(shù)都需要放射性標記的基板，種復雜的儀器，和特殊抗體，費時費力操作。已經(jīng)有了的新方法開發(fā)用于DNA MTase測定，例如比色法，熒光測定法，和生物發(fā)光測定法。但是，這些方法通常涉及繁瑣的納米粒子制備，雙熒光團猝滅劑雙標記，和長的分析時間。因為他們的獨特優(yōu)勢低成本，快速響應和小型化，電化學方法已被廣泛應用于DNA甲基化測定，但它們需要繁瑣的表面改性電極。因此，一種靈敏度高且簡單的簡單方法對于DNA MTase測定是具有實際意義的。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決以上現(xiàn)有技術中檢測DNA甲基轉移酶活性的方法特異性和靈敏度都比較低、檢測周期長的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、檢測速度快的基于催化發(fā)夾組裝放大的熒光法檢測DNA甲基轉移酶活性的生物傳感器。

一種檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器，包括均相反應液、目標物、輔酶SAM、MTase鏈、限制性內(nèi)切酶Dpnl、H1鏈、H2鏈、H3鏈、核酸內(nèi)切酶IV、Signal probe鏈；

所述的均相反應液包括滅菌水、1×的Dam緩沖液；

所述的DNA鏈的序列如下：

MTase如SEQ No.1所示；

H1如SEQ No.2所示；

H2如SEQ No.3所示；

H3如SEQ No.4所示；

Signal probe如SEQ No.5所示；

所述的Signal probe序列 的5’端第三個堿基T上修飾飾猝滅基團Dabcyl，第五個堿基上修飾四氫呋喃堿基位點；3’端第5個堿基修飾熒光基團FAM。

所述的輔酶SAM為提供甲基化的輔酶。

所述的目標物為甲基轉移酶Dam。

上述熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）將目標物即甲基轉移酶Dam、Dam緩沖液、MTase鏈以及提供甲基化的輔酶SAM同時加入到均相反應液中，反應結束后得到甲基化產(chǎn)物；

（2）向步驟（1）的甲基化產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Dpnl、H1鏈、H2鏈、H3鏈、核酸內(nèi)切酶IV、Signal probe鏈、1×cutsmart反應緩沖液，完成甲基化切割以及催化發(fā)夾自組裝反應；