[發明專利]一種檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器及其制備方法

在審

• 申請號: 201811632964.2
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109406477A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 黃加棟;趙一菡;劉素;王玉;瞿曉南;張儒峰;李莎莎;王業茹;孫文玉;張曼茹;江龍;趙崇政
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種檢測DNA甲基轉移酶活性的熒光生物傳感器，其特征在于，包括均相反應液、目標物、輔酶SAM、MTase鏈、限制性內切酶Dpnl、H1鏈、H2鏈、H3鏈、核酸內切酶IV、Signalprobe鏈；

所述的均相反應液包括滅菌水、1×的Dam緩沖液；

所述的DNA鏈的序列如下：

MTase如SEQ No.1所示；

H1如SEQ No.2所示；

H2如SEQ No.3所示；

H3如SEQ No.4所示；

Signal probe如SEQ No.5所示；

所述的Signal probe序列 的5’端第三個堿基T上修飾飾猝滅基團Dabcyl，第五個堿基上修飾四氫呋喃堿基位點；3’端第5個堿基修飾熒光基團FAM。

2.根據權利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，所述的輔酶SAM為提供甲基化的輔酶。

3.根據權利要求1所述的熒光生物傳感器，其特征在于，所述的目標物為甲基轉移酶Dam。

4.一種權利要求1所述的熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）將目標物即甲基轉移酶Dam、Dam緩沖液、MTase鏈以及提供甲基化的輔酶SAM同時加入到均相反應液中，反應結束后得到甲基化產物；

（2）向步驟（1）的甲基化產物中加入限制性內切酶Dpnl、H1鏈、H2鏈、H3鏈、核酸內切酶IV、Signal probe鏈、1×cutsmart反應緩沖液，完成甲基化切割以及催化發夾自組裝反應；

（3）將b步反應后的溶液（10 μL）稀釋至70 μL，熒光儀激發波長設置為486nm，發射波長為518nm，檢測范圍450nm-530nm，讀取熒光信號變化，檢測目標物。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（1）中MTase鏈的加入量為0.5μM；SAM的加入量為160μM，Dam的加入量為10U。

6. 根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）中甲基化產物、限制性內切酶Dpnl、1×cutsmart反應緩沖液、H1鏈、H2鏈、H3鏈、Signal probe的加入量比值為：5 μL：1μL：2μL：1μM：1μM：1μM：5μM；所述的限制性內切酶Dpnl的濃度為20U/μL；所述的核酸內切酶的最終濃度為0.5U/μL。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（1）的反應條件為37℃，60min。

8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟（2）的反應條件為37℃，90min。