[發(fā)明專利]一種檢測MTHFR基因rs1801133位點基因型的引物組、方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811630593.4
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109517893B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設計）人: 何震宇;黃曉婷;顧取良
• 申請（專利權）人: 廣東藥科大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/683;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝;舒勝英

本發(fā)明公開了一種檢測MTHFR基因rs1801133位點的引物組、方法及試劑盒。本發(fā)明在無需提取DNA的情況下，直接使用細胞作為模板進行無創(chuàng)檢測，它通過先后2輪PCR擴增獲得跨越MTHFR基因rs1801133位點的靶片段，采用了一種酶切產物電泳圖譜相互印證機制來保證分型結果的準確性，擴增所得靶片段通過錯配PCR技術在同一位置同時引入了2種酶的識別序列，可以分別使用2種快酶制作酶切產物電泳圖譜來印證彼此分型的準確性，避免了傳統(tǒng)設計在酶切不完全時可能導致的基因型誤判，提高了鑒定的準確性。本發(fā)明檢測流程操作簡便、快速、無需特殊儀器和設備，準確性得到了最大限度的保證。

技術領域

本發(fā)明屬于分子檢測領域，具體涉及一種檢測葉酸代謝通路關鍵酶——亞甲基四氫葉酸還原酶的編碼基因MTHFR基因rs1801133位點基因型的引物組、方法及試劑盒。

背景技術

亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸的關鍵酶，5-甲基四氫葉酸可以進一步進入甲基傳遞通路，參與體內嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白質的甲基化，同時維持體內正常的同型半胱氨酸水平。正常MTHFR活性才能維持葉酸甲硫氨酸循環(huán)的有效性，保證DNA的合成和甲基化的正常進行。若MTHFR酶活性發(fā)生變化，則導致5-甲基四氫葉酸生成障礙，引起DNA合成和甲基化異常、高同型半胱氨酸血癥而導致多種疾病的發(fā)生。

MTHFR基因rs1801133多態(tài)位點是中國人群中極為常見的多態(tài)位點，通常稱為C677T，Ala222Val或A222V，系開放讀碼框第665位堿基發(fā)生C→T轉換【對應于GenBank中mRNA序列NM_005957.4第894位堿基或基因組序列NG_013351.1的第14783位堿基】，導致多肽鏈第222位的丙氨酸變?yōu)槔i氨酸【NP_005948.3：p.Ala222Val】。

MTHFR基因C677T位點存在3種基因型，即CC型(野生型純合子)、CT型(雜合子)和TT型(突變型純合子)，它們的酶活性有較大的差異，分別為100％、71％、34％。很顯然該位點的突變型等位基因攜帶者，其葉酸代謝將會存在極大障礙，從而引發(fā)多種疾病，其中以新生兒缺陷及高同型半胱氨酸血癥引起的腦卒中最為嚴重。因此，檢測MTHFR基因C677T位點基因型可指導妊娠婦女合理個體化服用葉酸并防止不良妊娠結局以及出生缺陷的發(fā)生；可指導心腦血管疾病的一級預防和藥物治療；C677T基因多態(tài)性與5-氟尿嘧啶類腫瘤藥物的療效密切相關，可根據(jù)MTHFR基因型個體化給藥。

目前，MTHFR基因多態(tài)性檢測的方法主要有聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、實時熒光定量PCR(FQ-PCR)、基因芯片、高分辨率熔解曲線法(HRM)、PCR-金磁微粒層析法和二代測序法等，除PCR-RFLP法外，其他方法存在成本高、耗時、操作繁瑣等缺點。

PCR-RFLP法技術簡單，所用的儀器設備簡單，易于開展，目前常用HinfI、TaqI兩種酶酶切PCR產物來鑒定MTHFR基因C677T位點基因型，但現(xiàn)有方法在酶切不完全時容易造成基因型誤判，分析如表1。

表1以HinfI、TaqI檢測MTHFR基因C677T位點的基因型的相關例子

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種檢測MTHFR基因rs1801133多態(tài)位點的引物組。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測MTHFR基因rs1801133多態(tài)位點的試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種檢測MTHFR基因rs1801133多態(tài)位點的方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：