[發明專利]一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明

在審

• 申請號: 201811626897.3
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109486758A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 葛淑娟;張道強;劉傳杰;王金環;徐矯健;王玉娟;劉燕麗
• 申請（專利權）人: 青島麥迪賽斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 濟南方宇專利代理事務所(普通合伙) 37251
• 代理人: 俞波

本發明涉及細胞培養技術領域，且公開了一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，所述試劑包括以下組分：NK細胞擴增試劑：γ射線滅活的重組K562飼養細胞，CD52抗體，IL?2，CD16抗體，CD3抗體和CD56抗體，γ射線滅活的重組K562飼養細胞為經過100Gγ射線輻射致死的膜表達41BBL，IL?15的K562細胞系，該外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，制備得到的NK細胞，具有很高的純度和殺傷活性，經檢測培養至14天時，NK細胞純度可以達到90%以上，當效靶比為10:1時，NK細胞對K562細胞的殺傷活性可以達到80%以上，制備的NK細胞增殖速度快，培養至14?17天細胞擴增倍數達500以上，本發明制備的NK細胞有很好的靶向殺傷腫瘤細胞的效果。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體為一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明。

背景技術

NK細胞即自然殺傷細，1975年被發現，屬于非吞噬淋巴細胞，胞漿富含穿孔素和顆粒酶，具有識別和溶解腫瘤細胞的功能，目前，癌癥已經成為全球第一死亡原因。常規治療癌癥的手段有：手術、放療和化療三種方式。常規的治療方式雖然可以在短時間內有效減輕腫瘤負荷，但因為不能有效的清除腫瘤細胞和微小病灶，化療產生的耐藥、放療的腫瘤轉移等使腫瘤的臨床效果不佳，腫瘤復發比例增多。免疫細胞治療是繼手術、化療和放療之后的第四大治療腫瘤的新方式，其能系統殺滅腫瘤細胞，有效抑制腫瘤細胞的轉移，副反應小，臨床效果好。免疫細胞治療應用于臨床的有DC細胞、CIK細胞、細胞和NK細胞。NK細胞是第三類淋巴細胞，不同于T/B淋巴細胞，無需抗原刺激即可發揮細胞毒效應，能自發溶解多種腫瘤細胞和被病毒感染的細胞，還可以分泌多種細胞因子和趨化因子參與免疫調節。NK細胞的免疫治療在抗病毒，抗腫瘤的治療中有著廣泛的應用前景。近些年，臨床上將NK細胞用于免疫治療的例子在不斷增多。

目前，體外擴增NK系統主要通過以下三種方法：一是采用免疫磁珠的方法從PBMC中將NK細胞分離出來再培養；二單純的細胞因子組合刺激PBMC中NK細胞的擴增。三采用飼養細胞（基因修飾）的方法培養PBMC中的NK細胞；采用免疫磁珠的方法可以快速的獲得少量NK細胞，只能用于NK細胞研究，量少不適用于臨床，且成本高，操作復雜；現有的因子組合，NK細胞擴增倍數在150倍左右，NK細胞純度在50%左右，數量和純度上都無法滿足治療性回輸的要求，采用飼養細胞培養NK細胞可以獲得高純度NK細胞，但容易引來外來細胞系污染；本發明綜合第二種和第三種方法，用γ射線徹底滅活處理的GE-K562細胞與細胞因子聯合應用，篩選出最優組合。該組合在刺激NK細胞的數量和細胞殺傷功能上比傳統的擴增方法有較大改進，可以獲得大量高純度的安全有效的可用于臨床治療的NK細胞。

發明內容

（一）解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，試劑由γ射線滅活的飼養細胞和細胞因子組合而成，通過本發明的試劑擴增就可以得到大量高殺傷活性的NK細胞，培養過程簡單，完全可以滿足臨床需要。

（二）技術方案

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，所述試劑包括以下組分：NK細胞擴增試劑：γ射線滅活的重組K562飼養細胞，CD52抗體，IL-2，CD16抗體，CD3抗體和CD56抗體。

進一步的，所述γ射線滅活的重組K562飼養細胞為經過100Gγ射線輻射致死的膜表達41BBL和IL-15的K562細胞系。

進一步的，所述試劑的組成和含量為：滅活GE-K562細胞量為2^107cells，CD52抗體600ng，IL-2 800U，CD16mAb600ng，CD3mAb200ng和CD56mAb200ng。