[發明專利]一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明

在審

• 申請號: 201811626897.3
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109486758A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 葛淑娟;張道強;劉傳杰;王金環;徐矯健;王玉娟;劉燕麗
• 申請（專利權）人: 青島麥迪賽斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 濟南方宇專利代理事務所(普通合伙) 37251
• 代理人: 俞波

1.一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：所述試劑包括以下組分：NK細胞擴增試劑：γ射線滅活的重組K562飼養細胞，CD52抗體，IL-2，CD16抗體，CD3抗體和CD56抗體。

2.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：所述γ射線滅活的重組K562飼養細胞為經過100Gγ射線輻射致死的膜表達41BBL和IL-15的K562細胞系。

3.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：一支所述試劑的組成和含量為：滅活GE-K562細胞量為2^107cells，CD52抗體600ng，IL-2 800U，CD16mAb600ng，CD3mAb200ng和CD56mAb200ng。

4.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：所述試劑的各組分的使用濃度范圍分別為：滅活GE-K562細胞濃度為5^105cells/ml-1^106cells/ml，CD52抗體10ng/ml-50ng/ml，IL-2，20U/ml-60U/ml，CD16mAb10ng/ml-50ng/ml，CD3mAb1ng/ml-20ng/ml和CD56mAb1ng/ml-20ng/m。

5.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：所述試劑的各組分使用的優選濃度分別為：滅活GE-K562細胞濃度為7.5^10⁵cells/ml，CD52抗體30ng/ml，IL-2，40U/ml，CD16mAb30ng/ml，CD3mAb10ng/ml和CD56mAb10ng/ml。

6.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：包括以下步驟：

6.1分離PBMC：用淋巴分離液從外周血中分離獲得人外周血單核細胞PBMC，將PBMC接種到培養瓶中，并添加10%的自體血漿和終濃度為100IU/ml的IL-2，37℃，5%CO₂培養；

6.2 NK細胞的誘導和擴增：（1）步驟6.1中獲得的PBMC用培養基重懸，加入適量NK細胞擴增試劑，補加10%自體血漿，放入37℃，5%CO₂培養箱中培養至第三天，對半補加新鮮培養基和IL-2，其中IL-2的終濃度為50ng/ml；（2）以后每隔2或3天補加新鮮培養基和IL-2，維持細胞濃度在5^10⁵個/ml以上，每七天記錄細胞擴增倍數和NK細胞純度；

6.3收獲細胞：在培養的第17或21天，離心收集全部培養所得細胞。

7.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：所述步驟步驟6.1中，PBMC的接種濃度范圍為1^10⁶cells/ml-1.5^10⁶cells/ml。

8.根據權利要求1所述的一種外周血NK細胞體外高效擴增試劑及操作說明，其特征在于：一支NK細胞體外高效擴增試劑建議使用體積為20ml。