[發明專利]一種人臍帶間充質干細胞無血清培養基

在審

• 申請號: 201811621520.9
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109402051A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 王玉娟;徐矯健;葛淑娟;劉燕麗
• 申請（專利權）人: 青島麥迪賽斯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供了一種人臍帶間充質干細胞無血清培養基，其特征在于包括α?MEM基礎培養基，還包括如下組分：以終濃度計，谷氨酰胺1?20mM、HEPEs 1?20mM、腐胺10?100μM、轉鐵蛋白0.1?10μM、維生素C 10?400μM、重組胰島素1?10μM、黃體酮1?20nM、皮質醇10?200nM、人血白蛋白1?20mg/mL、堿性成纖維細胞生長因子1?10ng/mL、轉化生長因子β11?10ng/mL、螺旋藻速溶蛋白多糖1?50mg/mL。本發明提供的人臍帶間充質干細胞無血清培養基可顯著提高人臍帶間充質干細胞的增殖速率和貼壁性能，有利于人臍帶間充質干細胞的增殖和干細胞特性的保持，具有成脂、成骨誘導分化潛能。培養基成分簡單、明確、穩定，不含任何血清組分，克服了異種蛋白污染和致病微生物的危險，安全性高。

技術領域

本發明屬于干細胞培養技術領域，具體涉及一種人臍帶間充質干細胞無血清培養基的配方及其應用。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是來源于早期中胚層的成體干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，是造血微環境中的一種重要的細胞成分，可以向多種組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質細胞增殖分化，而且免疫原性弱，是組織工程立項的種子細胞來源。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)來源于新生兒臍帶中的華通氏膠，除具有MSCs的所有特性外，還具有含量豐富，細胞純凈，免疫原性更低，細胞原始、分化能力更強，無倫理限制等優勢，可為實驗和臨床提供充足的細胞來源，具有廣闊的臨床應用前景。

現有的用于培養hUC-MSCs的培養基主要分為三類。一類是基礎培養基中添加動物血清，弊端是無法規避動物血清中的異源體，可能存在人體異種蛋白污染或過敏，風險較大；第二類是基礎培養基中添加人血小板裂解液之類的血清替代物，但是同樣有成分不明的蛋白存在，批次差異較大，來源不穩定等缺點。第三類是基礎培養基中添加化學組分明確的血清替代成分，這既滿足了hUC-MSCs的培養要求，又有效避免了前兩類培養基的諸多不利因素。因此，適合hUC-MSCs細胞生長的化學配方確定的細胞培養基是干細胞走向臨床的重要條件。

然而，目前市面上正在銷售的商品化MSCs無血清培養基，無論是國外進口還是國內研發生產，不僅價格昂貴，細胞培養的效果也不理想。與血清培養體系相比細胞狀態差、細胞貼壁性差、操作繁瑣、細胞增殖速率不夠，而且細胞老化速度快，MSCs的分化能力降低。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，發明人通過反復的實驗驗證，獲得了一種新的人臍帶間充質干細胞無血清培養基，可以有效的對臍帶間充質干細胞進行培養。

本發明所提供的人臍帶間充質干細胞無血清培養基，是使用α-MEM基礎培養基，還包括如下組分及其濃度：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs 1-20mM、腐胺10-100μM、轉鐵蛋白0.1-10μM、維生素C 10-400μM、胰島素1-10μM、黃體酮1-20nM、皮質醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、堿性成纖維細胞生長因子1-10ng/mL、轉化生長因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。

所述的速溶蛋白多糖是從螺旋藻中提取的一種水溶性多糖，是一種無毒的天然生物活性物質，具有促進細胞生長、提高免疫力、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗衰老、對核酸內切酶活性和DNA修復合成有增強作用等功能。

所述的速溶蛋白多糖，其制備方法如下：將螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加熱，然后冷卻至常溫，減壓過濾分離，用鹽酸調節濾液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，離心15min離心；分離得到的上清液用Na₂CO₃溶液調節pH至7.0，然后噴霧干燥，得到藻蛋白多糖提取物。