[發明專利]心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201811620176.1
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109470848A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 吳偉東;劉清峰;姜峰
• 申請（專利權）人: 廣州市紅十字會醫院（暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院）
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述試劑盒主要組成：

熒光標記探針、抗MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體、抗鼠IgG抗體、固相膜、檢測卡。

2.根據權利要求1所述的一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述熒光標記探針為納米級高保真熒光標記探針；其制備方法為：利用膠乳表面的羧基與蛋白質的胺基連接，將蛋白質連接到膠乳顆粒的表面以制備熒光標記探針。

3.根據權利要求1所述的一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述抗MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體為熒光膠乳微粒標記抗MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體，其制備方法包括：

1）將熒光膠乳微球溶解于磷酸緩沖液中；

2）加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和碳化二亞胺，進行超聲清洗，時間為30s；

3）放置于室溫避光孵育30min以進行活化；

4）對其離心后沉淀用檸檬酸緩沖液溶解；

5）活化后的熒光膠乳以0.5mg/ml的比例將抗 MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體加入至熒光膠乳中；

6）混合均勻后于室溫攪拌反應，時間為2h；

7）采用磷酸緩沖液離心洗滌，重復3次操作；

8）沉淀后采用磷酸緩沖液溶解，并置于4℃的條件下儲存備用。

4.根據權利要求1所述的一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述的固相膜為硝酸纖維素膜。

5.根據權利要求1所述的一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述檢測卡的制備方法包括：首先采用包被緩沖液分別將抗MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體和抗鼠IgG抗體稀釋至1.0mg／ml，然后噴灑至硝酸纖維素膜上相對應的檢測區和質控區，在室溫處晾干以完成包被，最后在底襯上依次黏接貼樣品墊、包被膜及吸水紙，組裝成試劑檢測卡，置于4-30℃條件下儲存備用。

6.根據權利要求5所述的一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI試劑盒，其特征在于，所述的包被緩沖液的制備方法包括：將熒光膠乳微粒標記抗 MMPs、TIMPs及cTnI單克隆抗體以 1：50～1000比例稀釋到磷酸緩沖液中，并將其加入至結合墊中。

7.一種心肌損傷標志物MMPs、TIMPs及cTnI檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法主要包括：

S1、建立標準曲：

對MMPs、TIMPs及cTnI質控品稀釋為不同濃度，分別對每一種濃度重復測定若干次取均值，以質控品濃度為橫坐標 ，熒光信號強度測試值為縱坐標，建立擬合標準曲線；

S2、精密度與準確度測試：

抽取兩個批次的MMPs、TIMPs及cTnI檢測試劑，分別對MMPs、TIMPs及cTnI質控品中濃度為0.5、10.0、65.0ug／L的質控品進行測定，每個濃度重復20次，計算批內和批間各濃度測試結果的精密度，并統計各濃度測試結果偏倚情況；

S3、干擾試驗：

用試劑盒分別檢測含有2.0g／L膽紅素、30.0g／L三酰甘油、15.0g／L膽固醇的MMPs、TIMPs及cTnI質控品，質控品濃度分別為5.0ug／L和50.0ug／L；若測試結果相對偏差在±20％以內時，干擾物不影響標本測試；

S4、穩定性測試：

將成品試劑置于陰涼庫密封保存，于14個月內，期間每個月分別測試濃度為0.5、1.0、22.0、65.0ug／L的MMPs、TIMPs及cTnI質控品，每個濃度重復5次，檢測結果用均值±SD表示，若測試結果相對偏差在±20％以內，則判定試劑穩定性良好。