[發(fā)明專利]超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811618131.0
• 申請(qǐng)日: 2018-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111374093A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高倩;呂慎金;侯軍峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 高倩
• 主分類號(hào): A01K67/027
• 分類號(hào): A01K67/027;C12Q1/6888;C12Q1/6806;G01N33/92
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，包括雄性PPARα-/-小鼠（1）、雌性O(shè)B/ob小鼠（2）、PCR擴(kuò)增儀（7）、DNA擴(kuò)增產(chǎn)物（18）、2%瓊脂糖凝膠電泳（19）、鑒定依據(jù)（20）、瘦素基因（35），其特征在于；所述PCR擴(kuò)增儀（7）的內(nèi)部設(shè)置有PCR試劑盒（8），所述PCR試劑盒（8）的內(nèi)部設(shè)置有原料（9），所述原料（9）包括DNA雙鏈（10）、DNA單鏈（11）、引物（12）、TapDNA聚合酶（13）、腺嘌呤脫氧核苷酸（14）、鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（15）、胞嘧啶脫氧核苷酸（16）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（17），所述鑒定依據(jù)（20）包括白色脂肪組織（21）、棕色脂肪組織（22）、甘油三酯（23）、膽固醇（24）、肝臟（25）、脂肪肝（26）、葡萄糖（27）、胰島素（28）。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，其特征在于：所述雄性PPARα-/-小鼠（1）與雌性O(shè)B/ob小鼠（2）雜交得到雄性PPARα+/-/OB/ob雙雜合子小鼠（3）與雌性PPARα+/-/OB/ob雙雜合子小鼠（4），所述雄性PPARα+/-/OB/ob雙雜合子小鼠（3）與雌性PPARα+/-/OB/ob雙雜合子小鼠（4）雜交得到PPARα?ob/ob小鼠（5）、PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、雜合子（PPARα+/-）小鼠（30）、純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）、ob野生型（OB/OB）（32）、雜合子（OB/ob）小鼠（33）、純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）。

3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一條所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法其特征在于：所述PPARα?ob/ob小鼠（5）的內(nèi)部含有基因重組DNA（6）。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法其特征在于：所述DNA雙鏈（10）解離得到DNA單鏈（11），所述DNA單鏈（11）通過(guò)引物（12）與TapDNA聚合酶（13）的作用與腺嘌呤脫氧核苷酸（14）、鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸（15）、胞嘧啶脫氧核苷酸（16）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸（17）結(jié)合得到DNA擴(kuò)增產(chǎn)物（18）。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一條所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法其特征在于：所述DNA擴(kuò)增產(chǎn)物（18）通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳（19）進(jìn)行檢測(cè)，所述PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）顯示143bp一條條帶。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一條所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，其特征在于：所述雜合子（PPARα+/-）小鼠（30）顯示143 bp和280 bp兩條條帶，所述純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）顯示280 bp一條條帶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一條所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，其特征在于：所述ob野生型（OB/OB）（32）顯示155 bp一條條帶，所述雜合子（OB/ob）小鼠（33）顯示55 bp、100 bp和155 bp三條條帶。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-2任意一條所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，其特征在于：所述純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）顯示55 bp和100 bp兩條條帶。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的超級(jí)肥胖小鼠的構(gòu)建與鑒定方法，其特征在于：

a、正常日糧飼喂情況下，十六月齡純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）與PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）的體型差異不顯著，而瘦素基因（35）缺失顯著促進(jìn)了純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的體脂沉積，使PPARα?ob/ob小鼠（5）呈現(xiàn)超級(jí)肥胖，六周齡之前，PPARα?ob/ob小鼠（5）和純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的體重差異不顯著，前者的體重略低于后者，六周齡之后，PPARα?ob/ob小鼠（5）小鼠的體重開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，二十四周齡后，其體重顯著高于純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）,，PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）與純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）的體重差異不顯著，但顯著低于純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）和PPARα?ob/ob小鼠（5），PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）與純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）的采食量差異不顯著，后者略低于前者，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的采食量顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）和純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）的采食量，PPARα?ob/ob小鼠（5）的采食量顯著高于純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）的采食量，而顯著低于純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的采食量；

b、純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）呈現(xiàn)食欲過(guò)盛和肥胖，并伴隨著高血糖癥和高胰島素血癥，機(jī)體葡萄糖（27）和胰島素（28）耐受性顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32），純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）體形正常，但血液中的葡萄糖（27）水平降低，胰島素（28）水平升高，胰島素（28）參與調(diào)控脂肪細(xì)胞的生物學(xué)功能，而胰島素（28）抵抗在肥胖發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，胰島素（28）可以促進(jìn)脂肪組織從循環(huán)系統(tǒng)中吸收脂質(zhì)蛋白，促進(jìn)脂肪細(xì)胞生成脂質(zhì)，當(dāng)肥胖發(fā)生時(shí)，胰島素（28）信號(hào)通路遭到破壞，導(dǎo)致胰島素（28）抵抗；

c、葡萄糖（27）與胰島素（28）耐受性結(jié)果顯示，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）；

d、隨著年齡增加，PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）、純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）和PPARα?ob/ob小鼠（5）的脂肪重量均增加，且純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）和PPARα?ob/ob小鼠（5）的白色脂肪組織（21）、棕色脂肪組織（22）的重量及其增長(zhǎng)幅度顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）與純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31），三月齡純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）和PPARα?ob/ob小鼠（5）的白色脂肪組織（21）、棕色脂肪組織（22）的重量分別略高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、ob野生型（OB/OB）（32）與純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）；

e、六月齡小鼠的白色脂肪組織（21）重量分別為：PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）0.56 g，純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）1.19 g，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）4.22 g，PPARα?ob/ob小鼠（5）5.87 g，純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29），PPARα?ob/ob小鼠（5）顯著高于純合子敲除（ob/ob）小鼠（34），六月齡小鼠的棕色脂肪組織（22）重量分別為：PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）0.14 g，純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）0.24 g，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）1.19 g，PPARα?ob/ob小鼠（5）小鼠1.37 g；

f、肥胖發(fā)生過(guò)程中，多余的能量首先以甘油三酯（23）的形式儲(chǔ)存于白色脂肪組織（21）與棕色脂肪組織（22）中，當(dāng)白色脂肪組織（21）與棕色脂肪組織（22）的儲(chǔ)存能力達(dá)到飽和時(shí)，剩余的脂肪再儲(chǔ)存于肝臟中，,隨著年齡增長(zhǎng)，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）肝臟（25）內(nèi)積累的脂肪逐漸增多，并且純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）肝臟脂肪變性程度高于雜合子（PPARα+/-）小鼠（30），表現(xiàn)為脂滴增大，而PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）和純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）肝臟（25）內(nèi)無(wú)脂肪變性發(fā)生，此外，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的肝臟（25）重量顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）和純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31），表明其肝臟（25）發(fā)生了脂肪變性，并且純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的肝臟（25）重量高于純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）；

g、通過(guò)酶試劑盒檢測(cè)三月齡PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）、純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的肝臟（25）內(nèi)甘油三酯（23）和膽固醇（24）含量，結(jié)果顯示，純合子敲除（ob/ob）小鼠（34）的肝臟（25）內(nèi)甘油三酯（23）含量顯著高于PPARα野生型（PPARα+/+）小鼠（29）、純合子敲除（PPARα-/-）小鼠（31）。