[發明專利]一種液態奶中微生物總DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201811616564.2
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109504677A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 李松勵;李明;王加啟;鄭楠;趙圣國
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 付登云

本發明涉及一種液態奶中微生物總DNA的提取方法，所述提取方法包括細胞裂解過程、DNA純化過程、DNA回收過程和溶解DNA等過程。本發明的有益效果：所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，具有耗時短，步驟少，無裂解液浪費，提取的DNA質量比傳統方法更純，質量更高，提取的DNA量比傳統方法更大。

技術領域

本發明涉及一種DNA的提取方法，具體涉及一種液態奶中微生物總DNA的提取方法。

背景技術

液態奶樣品中微生物多樣性分析日顯重要，傳統的分離培養技術，菌種形態檢測技術等，一方面受到模擬培養環境上的挑戰，另一方面受到了準確性及靈敏性的限制。隨著高通量測序技術的發展及測序成本的大幅度降低，DNA水平上檢測牛奶中微生物的組成，有著高靈敏度，較高準確度的優勢。

16S擴增子測序技術是研究環境中原核微生物多樣性及群落組成差異的高通量測序技術之一，通過提取環境或者食品樣品的DNA，選擇合適的通用引物擴增16S的目標區域，通過檢測目標區域的序列變異和豐度，來研究微生物多樣性分布及差異分布。

發明內容

為了解決現有技術存在的問題，本發明提供了一種液態奶中微生物總DNA的提取方法，其具有耗時短，提取的DNA質量更純，更高等特點。

本發明的目的是提供一種液態奶中微生物總DNA的提取方法。

根據本發明的具體實施方式的液態奶中微生物總DNA的提取方法，所述提取方法包括以下步驟：

(1)樣品處理：室溫均質牛奶樣品，取1.0mL牛奶樣品進行離心，棄掉上清液，得到沉淀物；

(2)細胞裂解：在步驟(1)得到的所述沉淀物中Enzymatic Lysis buffer和lysozyme混勻后孵育，得到裂解液；

(3)純化DNA：在步驟(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿進行抽提，旋渦振蕩，直至白色懸濁液出現，室溫孵育5min，然后離心取上清液；

(4)回收DNA：在步驟(3)得到的所述上清液中加入Glycogen、醋酸鈉和異丙醇，混勻，-20℃孵育30min，離心棄掉上清液，并同時保留沉淀；

(5)溶解DNA：在步驟(4)得到的所述沉淀中加入75％無水乙醇進行洗滌，棄掉上清液，將沉淀室溫晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室溫孵育8-10min后，輕彈混勻或者輕微渦旋混勻，即可獲得檢測樣品。

其中，TE buffer或者ddH₂O為洗脫緩沖液。得到的檢測樣品也可以保存于-80℃的冰箱以便后續使用。

根據本發明的具體實施方式的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其中，步驟(1)中，將所述牛奶樣品室溫13000x g離心5min，沉淀樣品，棄掉上清液，得到沉淀物。

根據本發明的具體實施方式的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其中，步驟(2)中，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混勻后孵育，加入3μL蛋白質K，孵育1h，得到裂解液。

據本發明的具體實施方式的液態奶中微生物總DNA的提取方法，進一步的，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混勻后孵育，加入3μL蛋白質K，孵育1h，然后玻璃珠研磨10min，得到裂解液。玻璃珠研磨是玻璃珠的隨機碰撞，目的是物理性破壞菌體肽聚糖細胞壁，進一步降解細胞壁。加入玻璃珠后震蕩10min，由于劇烈震蕩造成試管內有較多氣泡，為了避免補液時液體外溢造成交叉污染，可以室溫條件下，13000xg離心3min，消除氣泡的影響。