[發明專利]一種液態奶中微生物總DNA的提取方法

在審

• 申請號: 201811616564.2
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109504677A
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 李松勵;李明;王加啟;鄭楠;趙圣國
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京細軟智谷知識產權代理有限責任公司 11471
• 代理人: 付登云

1.一種液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步驟：

(1)樣品處理：室溫均質牛奶樣品，取1.0mL牛奶樣品進行離心，棄掉上清液，得到沉淀物；

(2)細胞裂解：在步驟(1)得到的所述沉淀物中加入Enzymatic Lysis buffer和lysozyme混勻后孵育，得到裂解液；

(3)純化DNA：在步驟(2)得到的所述裂解液中加入酚氯仿進行抽提，旋渦振蕩，直至白色懸濁液出現，室溫孵育5min，然后離心取上清液；

(4)回收DNA：在步驟(3)得到的所述上清液中加入Glycogen、醋酸鈉和異丙醇，混勻，-20℃孵育30min，離心棄掉上清液，并同時保留沉淀；

(5)溶解DNA：在步驟(4)得到的所述沉淀中加入75％無水乙醇進行洗滌，棄掉上清液，將沉淀室溫晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室溫孵育8-10min后，輕彈混勻或者輕微渦旋混勻，即可獲得檢測樣品。

2.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(1)中，將所述牛奶樣品室溫13000x g離心5min，沉淀樣品，棄掉上清液，得到沉淀物。

3.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(2)中，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混勻后孵育，加入3μL蛋白質K，孵育1h，得到裂解液。

4.根據權利要求3所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL的lysozyme混勻后孵育，加入3μL蛋白質K，孵育1h，然后玻璃珠研磨10min，得到裂解液。

5.根據權利要求4所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，在所述沉淀物中加入500μL的Enzymatic Lysis buffer和1μL lysozyme，上下吹打混勻，37℃孵育1h，后，加入3μL蛋白質K到裂解液中，55℃熱孵育1h，得到重懸浮液，將所述重懸浮液轉移到一個含有0.8-1g玻璃珠子的離心管中振蕩10min，得到裂解液。

6.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，所述上清液中加入1倍體積的酚氯仿進行抽提，旋渦振蕩，直至白色懸濁液出現，室溫孵育5min，然后在4℃下，16000x g離心10min，取上清液。

7.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(3)中，向步驟(2)得到的所述上清液中加入0.2倍體積的10M醋酸銨，冰上孵育5min，然后在25℃下，13000x g離心10min，取第二次上清液，加入酚氯仿進行抽提，旋渦振蕩，直至白色懸濁液出現，室溫孵育5min，然后離心取上清液。

8.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(4)中，所述上清液中加入1μL的Glycogen、1/10體積的3M醋酸鈉和1倍體積異丙醇，所述醋酸鈉的pH為5.2，上下顛倒混勻5-6次，-20℃孵育30min，4℃，16000x g離心15min，棄掉上清液，并同時保持沉淀在離心管中。

9.根據權利要求1所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，步驟(5)中，在所述沉淀中加入新鮮配制的75％無水乙醇洗滌兩次，棄掉上清液，將沉淀室溫晾干3-5min；加入20μL TE buffer或者ddH₂O，室溫孵育8min后，輕彈混勻或者輕微渦旋混勻，即可獲得檢測樣品。

10.根據權利要求9所述的液態奶中微生物總DNA的提取方法，其特征在于，所述洗滌兩次具體為：在所述沉淀中加入新鮮配制的75％無水乙醇，上下顛倒混勻使白色沉淀完全漂浮在洗液中，4℃，16000x g離心5min，棄掉上清液，再加入新鮮配制的75％無水乙醇重復洗滌一次，去掉上清液，保留沉淀。