[發明專利]溶藻弧菌干粉化LAMP快速檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201811613281.2
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109517915A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 蔡芷荷;周楊;萬強;盧勉飛;曲曉瑩;吳清平;何天文
• 申請（專利權）人: 廣東環凱生物科技有限公司;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

本發明公開了溶藻弧菌干粉化LAMP快速檢測試劑盒，該試劑盒由干粉化檢測試劑、復溶液、陽性對照干粉、陰性對照干粉、封閉液、顯色液和裂解液組成，以上7種試劑分別置于容器中。應用于本試劑盒中的引物對應溶藻弧菌特異性基因序列的8個區段，6條引物，并且通過加入顯色液，陰陽性顯色差異明顯，具有特異性強、靈敏度高、易于操作、結果判斷簡單等優點，適合于食品安全和醫藥衛生領域中的溶藻弧菌快速檢測。另外，本發明為干粉化的檢測試劑，便于常溫運輸，且使用簡單、快捷，無需專門儀器，降低成本并拓寬產品應用范圍，更適用于現場及偏遠地區基層對溶藻弧菌的快速檢測，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及微生物分子生物學檢測試劑，具體涉及一種基于LAMP技術的干粉化溶藻弧菌核酸快速檢測試劑盒。

背景技術

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)作為一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，大面積分布于海洋環境中，并且廣泛寄生于大量海洋生物體內，其在侵染、增殖等過程中會產生相關毒素，破壞宿主體內正常新陳代謝，造成宿主組織、細胞等嚴重損傷，甚至是死亡。在水產養殖中，溶藻弧菌是引發各種魚類、蝦蟹、貝類以及甲殼類等致病、死亡的主要條件致病菌，其疫情大面積爆發直接給該養殖行業造成不可估量的經濟損失。另外，人體會由于進食被溶藻弧菌污染的水產品而感染，造成急性胃腸炎、外耳炎、中耳炎、傷口創面感染，甚至是敗血癥等病癥，嚴重威脅其身心健康。因此，在生產生活中，尤其是水產品相關的微生物檢測中，溶藻弧菌屬于日常監測、檢疫的重點對象。

目前，水產養殖行業一般通過廣泛使用抗生素來控制溶藻弧菌疫情，這樣會導致嚴重的菌株耐藥性，其危害也會加劇。雖然當前已建立了多種溶藻弧菌檢測方法，主要包括采用傳統培養基法(病原微生物分離鑒定、形態學鑒定及自動化鑒定方法)、酶聯免疫技術、核酸探針技術、核酸擴增(PCR)技術等，但這些方法表現出檢測周期長、操作復雜、儀器昂貴以及成本高等不足，并且多局限在實驗室檢測，難以滿足在基層現場的快速檢測需求。可見，尋求一種能夠快速、準確地鑒定出溶藻弧菌的方法具有重要的意義。

目前國內主要以微生物分離培養和形態學鑒定為主、結合生化鑒定和血清學分型鑒定等通行方法進行食品微生物學相關檢驗，其初步鑒定一般需要2～3天，而最終完成鑒定報告則需10～15天。整個檢測過程十分漫長，難以滿足快速檢測的需要。

LAMP技術是由Notomi等人于2000年開發的一種新型的體外恒溫擴增特異核酸片段的技術。該技術利用兩對特殊引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶。使反應中在模板兩端引物結合處循環出現環狀單鏈結構，在恒溫條件下使引物順利與模板結合并進行鏈置換擴增反應，與常規PCR相比，無需反復變溫、電泳判讀等過程，在靈敏度、特異性和檢測范圍等技術指標上能媲美甚至高于PCR技術，而不依賴專門的儀器可以實現現場的快速檢測，其成本遠低于熒光定量PCR。

LAMP引物設計主要是針對靶基因的六個不同的區域，基于靶基因6個區域設計的4條特殊引物，并增加2條靶向擴增反應中形成的環狀結構的環引物。在引物設計時候，應注意以下問題：在靶點的選擇上為特異基因的保守序列，靶序列長度超過500bp會顯著降低LAMP的擴增效率，最佳靶序列長度應為150bp～180bp；引物的GC含量在40～65％；對于GC含量豐富的序列，引物區的Tm值控制在60℃～65℃，AT含量豐富的序列，引物區的Tm值則控制在55℃～60℃；為了保持引物末端的穩定性，其末端穩定性自由能(ΔG)值小于-4kcal/mol；引物設計應避免出現二級結構；環引物的加入可以把原來的LAMP反應縮短一半左右，但在引物設計中，其設計區域常常因為序列區間長度不夠無法用軟件生成，因此會出現只有1條環引物或沒有環引物序列符合條件，此時通過標記設計區域進行手動設計；引物的設計滿足以上條件的一般為5～10套，實際擴增效果仍然需要通過反應擴增的各種參數，如靈敏度、指數增長期的起始時間、擴增產物量等，如果只采用單一引物組，不能保證所選的引物能夠進行高效擴增。