[發(fā)明專利]溶藻弧菌干粉化LAMP快速檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811613281.2
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109517915A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡芷荷;周楊;萬強(qiáng);盧勉飛;曲曉瑩;吳清平;何天文
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東環(huán)凱生物科技有限公司;廣東環(huán)凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/63
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 許飛

1.一種溶藻弧菌的LAMP引物組，包括外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP以及環(huán)引物L(fēng)F/LB，其特征在于：其序列如下：

溶藻弧菌-F3：atgcgtcatgcactgctattatc

溶藻弧菌-B3：tcgtagcggctagcgaagctag

溶藻弧菌-FIP：gtcgactgcgcgtgacggtgcgctccgcaatatggatcatcg

溶藻弧菌-BIP：tgcagctgtgcgtgcgagtgagtagagcgagcttcgctgtctc

溶藻弧菌-LF：atgctgctgacgtgtctgcag

溶藻弧菌-LB：gtcgagtgctgctgatcgtcgg。

2.一種溶藻弧菌的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：其LAMP引物組如權(quán)利要求1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：檢測試劑盒包括復(fù)溶液、陽性對照干粉、陰性對照干粉、顯色液、裂解液、封閉液和干粉化的檢測試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：干粉化的檢測試劑凍干前的組成為：0.7～2.0mmol/L dNTPs、0.3～0.5U/μL Bst DNA聚合酶、0.1～0.8μmol/L外引物F3/B3、1.2～2.0μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、0.6～1.8μmol/L環(huán)引物L(fēng)F/LB、100～400μmol/L MnCl₂以及含3％～6％海藻糖(w/v)、0.01％～0.1％甘氨酸(w/v)、0.1％～1％牛血清白蛋白的凍干復(fù)合保護(hù)劑，余量為無菌超純水。

5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：復(fù)溶液含有：1～1.2mmol/L MgSO₄、5～15mmol/L KCl、10～25mmol/L Tris-HCl、5～15mmol/L(NH₄)₂SO₄、0.1～0.5％Triton X-100以及0.3～2.0mol/L甜菜堿。

6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：顯色液為10～85μmol/L鈣黃綠素。

7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：裂解液含有：5～35mmol/L Tris-HCl，pH 8.3、0.5～1.5mmol/L EDTA以及0.2～1.3％SDS。

8.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：封閉液為無菌石蠟油。

9.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：陽性對照為提純的溶藻弧菌基因組DNA制成的凍干粉，陰性對照為提純的非溶藻弧菌基因組DNA制成的凍干粉。

10.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的干粉化LAMP快速檢測試劑盒，其特征在于：其使用方法包括如下步驟：

1)參照SN/T 2754.12-2011《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)檢測方法第12部分：溶藻弧菌》，根據(jù)NMKL No.156進(jìn)行樣品制備和增菌，接種20g食品樣品于200mL 3％氯化鈉堿性蛋白胨水中，36±1℃進(jìn)行增菌10±2h；

2)取以上增菌液1～2mL經(jīng)6000r/min離心，去上清；

3)分別向(2)中離心得到沉淀中加入裂解液，充分懸浮，99℃熱裂解10min，裂解結(jié)束后12000r/min離心15min，上清即為待檢樣品粗提核酸；

4)取干粉化的檢測試劑，加入復(fù)溶液，待干粉化的檢測試劑充分溶解后，將待檢測的樣品核酸加入反應(yīng)管中，對照管分別加入經(jīng)無菌超純水溶解的溶藻弧菌基因組DNA作為陽性對照，以無菌超純水溶解的非溶藻弧菌基因組DNA為陰性對照，加入顯色液，充分混勻后加入封閉液，設(shè)置63℃恒溫反應(yīng)；

5)反應(yīng)后結(jié)果判讀：反應(yīng)結(jié)束后，觀察結(jié)果，陰性對照反應(yīng)后呈淡橙色，陽性對照反應(yīng)后呈熒光綠，待測樣品反應(yīng)管以此作為對照進(jìn)行判讀，若陰陽對照反應(yīng)管任一結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測。