[發明專利]一種牡丹的基因組原位雜交方法及其應用

在審

• 申請號: 201811610043.6
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109735602A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 鐘原;杜明杰;成仿云
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及一種牡丹的基因組原位雜交方法及其應用。本發明提供一種牡丹的基因組原位雜交方法，其采用三步法對包含探針DNA和封阻DNA的雜交混合液以及待檢測染色體進行變性處理，將變性后的雜交混合液和染色體雜交；所述三步法為分別將雜交混合液和染色體進行變性處理后，再將雜交混合液和染色體混合進行共變性處理。本發明通過對基因組原位雜交的條件參數進行全面的調整和優化，得到了高效的牡丹基因組原位雜交方法，其雜交成功率和特異性顯著提高，雜交信號在染色體上具有更高的清晰度，能夠準確區分來自于雜交雙親本的染色體，可以在實踐中用于牡丹的種質鑒定及雜交育種的遺傳分析。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種牡丹的基因組原位雜交方法及其應用。

背景技術

牡丹屬于芍藥科芍藥屬牡丹組，為中國的傳統名花，栽培應用的歷史悠久，具有較高的觀賞及應用價值。經過1600多年的人工選育，牡丹形成了眾多的優良品種。其中亞組間遠緣雜交在品種培育過程中發揮了極其重要的作用，目前，美國牡丹芍藥協會已登錄的牡丹亞組間雜交品種有426個。但對于牡丹亞組間遠緣雜交成功的機理、遠緣雜種的遺傳組成等研究還十分缺乏。對牡丹亞組間遠緣雜交后代染色體的研究，有利于揭示雜種后代的雜交機理，為牡丹的遠緣雜交育種提供一定的指導。

染色體的識別是染色體研究的基礎工作。染色體的識別是指通過一定的標記將不同的染色體區分開，包括染色體組、單個染色體以及染色體片段，這一直是細胞遺傳學研究的重要內容(Kato et al.，2005)。

壓片法開啟了染色體核型分析的開端且一直是核型分析的常用手段之一(Belling，1921)。傳統的核型分析以染色體的基礎測量數據如相對長度、著絲點位置及臂比值等為染色體識別的依據,在最初的研究中扮演了重要的角色。關于芍藥屬牡丹組植物的核型分析，已有前人做過大量的工作，涉及牡丹的所有野生種及栽培牡丹的多個品種，為該組植物細胞學研究奠定了理論基礎，對確定野生種分類地位、演化關系及遺傳育種工作等具有重要的價值。(Stebbins，1938；李懋學等，1982；王蓮英等，1983；于兆英等，1987；張贊平等，1988；洪德元等，1988；龔洵等，1991)。傳統的核型分析對于形態相近的染色體或區段變異的區分缺乏準確性，因此需要可以進一步顯示染色體的內部結構的技術來進行染色體的準確識別。

染色體顯帶技術可通過一定技術顯現染色體的紋路，進行染色體內部結構的識別，若染色體結構發生變異，帶紋也可能發生變化，可用來區分各條染色體以及初步鑒定染色體的變異，是染色體識別從外部形態研究向內部結構研究的一個轉折點(Casperson etal.，1968)。染色體顯帶技術包括C帶、G帶、銀染法、N帶、R帶、T帶等多種帶型分析方法。另外，高分辨顯帶技術使染色體分帶細、帶紋可達800條甚至更多，染色體識別更為準確，在臨床醫學和植物染色體識別等方面皆有應用(Yunis，1976)。染色體顯帶技術在牡丹中也有一定的應用，C帶及銀染帶等的分析結果可作為鑒別種及品種的依據(張贊平等，1990；于玲等，1997；裴彥龍，1993)。

對于一些染色體較小，濃縮程度高且形態相近的物種，染色體經顯帶技術處理后不能產生相應的帶紋或產生的帶紋有限，因此仍難以準確識別所有的染色體。染色體原位雜交技術(in situ hybridization)可通過探針與靶DNA的結合產生的熒光信號位點進行染色體的準確識別。該方法使用標記的核酸序列作為探針，與染色體上的靶DNA進行雜交，由于探針在不同染色體上組成、分布、位置和重復數的不同，可進行染色體的準確識別，應用較為廣泛。