[發明專利]一種牡丹的基因組原位雜交方法及其應用

在審

• 申請號: 201811610043.6
• 申請日: 2018-12-27
• 公開（公告）號: CN109735602A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 鐘原;杜明杰;成仿云
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.一種牡丹的基因組原位雜交方法，其特征在于，采用三步法對包含探針DNA和封阻DNA的雜交混合液以及待檢測染色體進行變性處理，將變性后的雜交混合液和染色體雜交；

所述三步法為分別將所述雜交混合液和所述待檢測染色體進行變性處理后，再將變性后的雜交混合液和染色體混合，進行共變性處理；

所述雜交混合液的變性為將雜交混合液于95～98℃變性10～15min；

所述待檢測染色體的變性為將待檢測染色體玻片于甲酰胺溶液中70～75℃水浴變性3～5min；

所述共變性為將經變性處理的雜交混合液與待檢測染色體混合，于80～85℃變性10～15min。

2.根據權利要求1所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，所述雜交混合液中探針DNA與封阻DNA的質量比為1：10～1：50；

優選地，所述雜交混合液中探針DNA與封阻DNA的質量比為1:25～1:40。

3.根據權利要求1或2所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，所述探針DNA的片段大小為200～500bp；所述探針DNA采用放射性或非放射性物質標記；優選采用地高辛標記。

4.根據權利要求1～3任一項所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，所述探針DNA的制備為將牡丹的總基因組DNA與DIG-Nick Translation Mix混合，于15℃避光反應60～70min；

優選地，所述DIG-Nick Translation Mix的用量為4～6μL/μg總基因組DNA。

5.根據權利要求1～4任一項所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，所述封阻DNA的片段大小為200～500bp；

優選地，所述封阻DNA的制備為將牡丹的總基因組DNA于沸水浴中煮沸處理150～300min。

6.根據權利要求1～5任一項所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，所述封阻DNA來源于與待檢測牡丹的雜交親本同種的牡丹的基因組DNA。

7.根據權利要求1～6任一項所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)染色體玻片標本的制備和預處理：對待檢測牡丹的組織進行預處理、固定和酶解后，采用去壁低滲火焰干燥法制備待檢測牡丹的染色體玻片，再對染色體玻片進行酶解預處理；

(2)探針標記及封阻DNA制備：將牡丹的總基因組DNA與DIG-Nick Translation Mix混合，于15℃避光反應60～70min，得到探針DNA；

將牡丹的總基因組DNA于沸水浴中煮沸處理150～300min，得到封阻DNA；

(3)染色體和探針的變性：將步驟(1)制備的經預處理的染色體玻片于70％的甲酰胺中70～75℃變性3～5min，在預冷的乙醇中逐級脫水、干燥；

將包含探針DNA和封阻DNA的雜交混合液于95～98℃變性10～15min；

將經變性處理的雜交混合液加入至經變性處理的染色體玻片，于80～85℃變性10min；

(4)雜交

將步驟(3)得到的經變性處理的雜交混合液與待檢測染色體的混合物于37℃雜交12-16h；

(5)洗脫與信號檢測：步驟(4)得到的雜交產物經洗脫、封閉處理后，添加熒光標記的抗地高辛抗體處理，經洗滌后，添加抗熒光衰減劑，封片。

8.根據權利要求7所述的基因組原位雜交方法，其特征在于，步驟(5)中所述洗脫包括采用30％～50％的去離子甲酰胺溶液洗脫雜交產物的步驟。