[發(fā)明專利]一種利用聯(lián)合法從胎盤絨毛膜中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811608045.1
• 申請日: 2018-12-26
• 公開（公告）號: CN109762781A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉召青;年泗利;張亮亮;齊念民
• 申請（專利權(quán)）人: 上海坤愛生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海漢聲知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 周君;胡晶

本發(fā)明公開了一種利用聯(lián)合法從胎盤絨毛膜中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括胎盤預(yù)處理后，將胎盤絨毛膜組織通過部分消化法進(jìn)行初步分解，再利用部分消化后的松散產(chǎn)物通過組織接種的方式，通過培養(yǎng)制備得到胎盤多能干細(xì)胞的步驟；然后再將原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并收集的步驟；最后進(jìn)行程序降溫凍存，將溫度降至?80℃后取出樣本，轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存，優(yōu)點是快速收獲較多的均一、穩(wěn)定的原代細(xì)胞，并能夠持續(xù)傳代，不僅具有較高的克隆形成能力，還能夠穩(wěn)定的表達(dá)胎盤間充質(zhì)表面標(biāo)記。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞分離提取領(lǐng)域，具體涉及一種利用聯(lián)合法從胎盤絨毛膜中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在胚胎發(fā)育中來源于中胚層，之后幾乎分布于機(jī)體的所有器官與組織中；MSCs具有分化為多種中胚層細(xì)胞系的潛能，如骨、軟骨、肌腱、脂肪、肝、腎、皮膚、肌肉、神經(jīng)甚至胰腺等，因而成為再生醫(yī)學(xué)中器官修復(fù)等領(lǐng)域的理想種子細(xì)胞。

間充質(zhì)干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，其有三個主要來源：骨髓、脂肪組織、胎盤，其中，以胎盤中存量最多，也最接近胚胎干細(xì)胞；一直以來由于對胎盤干細(xì)胞知識缺乏了解，使得胎盤分娩后便當(dāng)做醫(yī)療廢物丟棄，若充分利用這些干細(xì)胞資源，便能夠造福于萬千家庭、造福于社會；

近年來，隨著對胎盤研究的深入，不僅充分認(rèn)識并利用了臍帶血，也充分認(rèn)識了胎盤類干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)上的重要作用，胎盤中不僅含有豐富的造血干資源，也含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞；

胎盤是母體與胎兒間營養(yǎng)交換的通道，也形成胎盤屏障；母體面以底蛻膜將母體與胎兒分開，胎兒面則以羊膜與胎兒隔離開，并通過臍帶連通胎兒，為胎兒提供營養(yǎng)；

胎盤絨毛膜構(gòu)成胎盤的胎兒部分，是胎盤的主要部分，其中含有豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞資源，目前，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的提取主要有組織團(tuán)法、消化法兩種，但兩者各有弊端：組織團(tuán)法不能將組織塊內(nèi)部的細(xì)胞爬出，造成培養(yǎng)成功率低、形態(tài)較差且收獲率低；消化法則存在過度消化，破壞細(xì)胞的正常狀態(tài)，嚴(yán)重影響細(xì)胞的活性；因此亟待需要有新的有效的胎盤干細(xì)胞提取方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有充質(zhì)干細(xì)胞提取收獲效率低、活性差等問題，本發(fā)明提供了一種利用聯(lián)合法從胎盤絨毛膜中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，將組織塊部分消化內(nèi)部松散之后再貼壁培養(yǎng)，具體包括以下步驟：

步驟一、選取胎盤，并對胎盤進(jìn)行檢測，確保其全陰性；剪取胎盤上新鮮的絨毛膜樣品組織；

步驟二、將剪取獲得的樣品組織置于磷酸緩沖鹽溶液中進(jìn)行清洗；

步驟三、挑取顏色鮮艷的清洗好的樣品組織，去除可見大血管、殘余胎盤隔組織，再將樣品組織剪成樣品組織碎片；

步驟四、在樣品組織碎片中加入消化液，并進(jìn)行搖晃消化；待消化進(jìn)行到30％-70％時，再通過培養(yǎng)液終止，獲得其中松散的組織塊；

步驟五、將松散組織塊平鋪接種于培養(yǎng)容器中，靜置；

步驟六、待培養(yǎng)容器中的組織塊的周圍干燥后，加入培養(yǎng)液，以使得組織塊與培養(yǎng)液充分接觸，再將其放入到培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

步驟七、待組織塊周圍細(xì)胞形成密集集落時，進(jìn)行傳代；

步驟八、傳代培養(yǎng)完成后，采用磷酸緩沖鹽溶液進(jìn)行清洗，再用重組消化酶或胰酶消化后，待細(xì)胞變圓、脫落，停止消化，終止后收集細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液去上清，將細(xì)胞沉淀重懸，按每皿不低于2.0×105個細(xì)胞接種于平皿中；

步驟九、待細(xì)胞長至80-90％密度時，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行凍存。

較佳地，步驟一中選取好的胎盤需經(jīng)過乙肝、丙型肝炎、梅毒、艾滋、巨細(xì)胞病毒的檢測，確保全陰性。